FoxO调控转运蛋白ABCA6表达的机制研究

发布时间：2019-01-27 16:44

【摘要】：目的：ABC转运蛋白(ATP binding cassette transporters)是一组跨膜蛋白,以ATP为能源介导脂类等多种分子的跨膜转运。人类ABC转运蛋白包括A-G7个亚家族。ABCA6是ABCA亚家族成员,其表达调节和生物功能目前并不明确。我们通过生物芯片分析(microarray)发现,过表达转录因子FoxO的人血管内皮细胞中ABCA6的表达明显上调。本研究着重探讨FoxO调控ABCA6表达的分子机制,并对ABCA6的功能进行了初步探索。 方法：分别用FoxO表达质粒或FoxO SiRNA转染细胞,通过real-time PCR检测ABCA6mRNA表达的变化。克隆人ABCA6转录起始位点上游大约800bp的启动子序列,构建报告基因质粒,将FoxO与ABCA6报告基因质粒共转染细胞,检测荧光素酶的活性；构建系列删减或突变的报告基因质粒,通过测定荧光素酶活性的改变确定ABCA6启动子上FoxO的结合位点。为进一步证实FoxO与ABCA6启动子的结合,我们通过EMSA观察了在体外FoxO与ABCA6启动子的结合情况,并利用CHIP实验检测了在细胞内FoxO与ABCA6启动子的结合。此外,我们通过Western Blot观察了葡萄糖缺乏时细胞内FoxO的表达变化,并用real-time PCR检测了ABCA6mRNA的水平。为进一步研究ABCA6的功能,我们构建了ABCA6表达质粒并建立了稳定转染ABCA6的细胞株,通过荧光免疫组化和共聚焦显微镜观察ABCA6在胞内定位,并用real-time PCR检测了脂质代谢相关基因Insigl表达的变化。 结果：在人血管内皮细胞,过表达有自发活性的FoxO1TM, FoxO3TM引起ABCA6表达明显上调；转染FoxO1或FoxO3SiRNA导致ABCA6表达下降。用rVista工具对人ABCA6启动子进行分析,发现有2个可被FoxO识别的结合序列。FoxO1、FoxO3和FoxO4均能明显激活ABCA6启动子启动的荧光素酶报告基因的表达；删减或突变ABCA6启动子上任一结合位点则明显抑制FoxO对ABCA6启动子的激活,提示FoxO激活ABCA6转录的效应与上述2个结合位点有关。与之一致,EMSA结果显示,过表达FoxO的核蛋白与ABCA6启动子发生明显结合；CHIP实验发现,内源性FoxO经特异性抗体免疫沉淀后,可扩增出包含FoxO结合位点的ABCA6启动子片段。我们还发现,葡萄糖缺乏导致细胞内FoxO表达明显下降,此时ABCA6mRNA水平也明显降低。此外,免疫组化染色及荧光共聚焦显微镜观测显示,ABCA6主要分布于细胞内富含游离胆固醇的高尔基体；real-time PCR检测发现,稳定转染ABCA6的细胞中Insigl表达明显下降。 结论：在人血管内皮细胞中ABCA6的表达依赖于FoxO; FoxO能显著激活ABCA6启动子;FoxO通过与ABCA6启动子上两个位点的直接结合而调节ABCA6的转录。葡萄糖缺乏时,细胞内FoxO表达明显下降,ABCA6mRNA水平也明显降低。ABCA6定位于细胞内高尔基体,可能参与胆固醇的转运和代谢。
[Abstract]:Aim: ABC transporter (ATP binding cassette transporters) is a group of transmembrane proteins. ATP is used as energy source to mediate the transmembrane transport of lipids and other molecules. Human ABC transporters include A-G7 subfamilies. ABCA6 is a member of ABCA subfamily, and its expression regulation and biological function are not clear. We found that the expression of ABCA6 was up-regulated in human vascular endothelial cells overexpression of transcription factor FoxO by biochip (microarray) analysis. This study focuses on the molecular mechanism of ABCA6 expression regulated by FoxO and the function of ABCA6. Methods: FoxO expression plasmid or FoxO SiRNA were used to transfect the cells, and real-time PCR was used to detect the changes of ABCA6mRNA expression. The promoter sequence of human ABCA6 transcription initiation site was cloned and the reporter gene plasmid was constructed. The FoxO and ABCA6 reporter gene plasmids were co-transfected to detect the luciferase activity. A series of reporter gene plasmids with deletion or mutation were constructed and the binding sites of FoxO on ABCA6 promoter were determined by determining the changes of luciferase activity. In order to further confirm the binding of FoxO to ABCA6 promoter, we observed the binding of FoxO to ABCA6 promoter in vitro by EMSA, and detected the binding of FoxO to ABCA6 promoter by CHIP assay. In addition, we observed the expression of FoxO in glucose deficient cells by Western Blot and detected the level of ABCA6mRNA by real-time PCR. In order to further study the function of ABCA6, we constructed a ABCA6 expression plasmid and established a cell line stably transfected with ABCA6. The localization of ABCA6 in cells was observed by fluorescence immunohistochemistry and confocal microscopy. The changes of Insigl expression of lipid metabolism related genes were detected by real-time PCR. Results: in human vascular endothelial cells, overexpression of spontaneous FoxO1TM, FoxO3TM resulted in a significant up-regulation of ABCA6 expression, while transfection of FoxO1 or FoxO3SiRNA led to a decrease in ABCA6 expression. RVista analysis of human ABCA6 promoter showed that there were two binding sequences recognized by FoxO. Both FoxO1,FoxO3 and FoxO4 could significantly activate the expression of luciferase reporter gene initiated by ABCA6 promoter. Deletion or mutation of ABCA6 promoter at one binding site significantly inhibited the activation of ABCA6 promoter by FoxO, suggesting that the effect of FoxO on ABCA6 transcription was related to the two binding sites mentioned above. In line with the EMSA results, the nucleoprotein overexpression of FoxO was significantly associated with the ABCA6 promoter, and CHIP assay showed that the ABCA6 promoter fragment containing FoxO binding sites could be amplified by specific antibody immunoprecipitation of endogenous FoxO. We also found that glucose deficiency resulted in a significant decrease in FoxO expression and a significant decrease in ABCA6mRNA levels. In addition, immunohistochemical staining and fluorescence confocal microscopy showed that ABCA6 was mainly distributed in Golgi body, which was rich in free cholesterol, and the expression of Insigl in stable transfected ABCA6 cells was significantly decreased by real-time PCR assay. Conclusion: the expression of ABCA6 in human vascular endothelial cells depends on the activation of ABCA6 promoter by FoxO; FoxO, and FoxO regulates the transcription of ABCA6 by directly binding to two sites of ABCA6 promoter. When glucose was deficient, the expression of FoxO and the level of ABCA6mRNA decreased significantly. ABCA6 was located in Golgi body and might be involved in the transport and metabolism of cholesterol.
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R364

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本文编号：2416473