RNF114蛋白在小鼠早期胚胎发育中的功能研究及机制探索

发布时间：2019-02-09 11:28

【摘要】：哺乳动物生殖细胞在减数分裂过程中，其基因组是转录沉默的。在小鼠，广泛的胚胎基因组激活于2细胞晚期开始；在人，胚胎基因组的激活发生于4-8细胞期。在胚胎基因组激活之前，胚胎的发育由卵细胞发生过程中积累并储存于成熟卵母细胞胞质中的母源因子(包括mRNA和蛋白质)所调控。在卵子受精或核移植的胚胎激活后，这些母源因子启动早期胚胎的发育，胚胎基因组开始转录，表达新的基因，合成新的因子，并发生级联反应，合成更多的细胞因子，维持早期胚胎继续发育。即使在胚胎基因组激活后，持续存在的母源因子仍可与其它的母源因子一起，或者通过与新表达的合子基因产物相互作用促进早期胚胎发育。因此对母源因子的研究，将有助于我们深入了解早期胚胎发育过程中的重要事件和调控机制，并为寻找早期体外培养胚胎发育失败的原因以及提高体外培养胚胎发育的成功率提供理论基础。 本实验室前期工作中，，通过蛋白质组学的方法从小鼠的MII期卵母细胞蛋白谱系中鉴定出RNF114（RING finger protein114）蛋白，它是一个在卵母细胞中缺乏相应的功能研究的蛋白质，同时另有研究证实RNF114蛋白在胚胎干细胞诱导分化前后均有表达，且在胚胎干细胞诱导分化后表达量较未分化时降低。我们研究证实其mRNA在卵细胞及受精卵中表达量最高，卵裂后其表达量显著下降并在早期胚胎中维持较低的表达水平，而荧光定位显示RNF114蛋白自小鼠GV期卵母细胞到囊胚阶段持续表达。以上结果提示我们，在小鼠合子基因组转录激活后，RNF114基因的转录活性低，RNF114mRNA和/或蛋白质主要在卵细胞成熟的过程中聚集,可能作为一个母源性因子在早期胚胎发育过程中发挥作用。此外，对RNF114进行结构域分析显示该蛋白有一个RING finger结构域及两个C2H2zinc finger结构域，提示我们RNF114在早期胚胎中可能作为一个E3连接酶，通过对下游底物的泛素化，调节其降解或转录活性，从而发挥生物学作用。 我们首先用两对siRNAs特异性阻断RNF114蛋白在小鼠早期胚胎发育过程中的功能，观察到囊胚的形成率降低且囊胚细胞数目减少，并且囊胚中内细胞团和滋养层细胞构成比发生偏移（内细胞团细胞数减少高于滋养层细胞数减少）。此外，我们还通过体外底物非依赖泛素化反应验证了RNF114蛋白的E3活性，并且通过蛋白质芯片技术筛选到了40种底物蛋白。随后我们利用底物依赖的体外泛素化反应和Western blot的实验方法对部分底物蛋白分别进行了体外和体内的验证，证实了Cd74、Optn、Psat1、Rab3il1、Tnip1这5个蛋白确实为RNF114的底物，此外也证实了RNF114作为一个E3泛素连接酶介导了底物蛋白的降解。前人已有报道过表达Tnip1和Optn蛋白能抑制肿瘤坏死因子（TNF）诱导的NF-kB活性从而导致细胞周期和细胞增殖受阻，细胞凋亡增加；同时也有文献报道过表达Cd74可通过正反馈调节ERK活性从而破坏ES细胞的全能性并促进分化。因此，我们推测RNF114通过对一些参与ERK/NF-kB信号通路的相关因子进行泛素化修饰，调节其降解途径，从而参与早期胚胎发育过程中细胞增殖与分化、细胞凋亡、胚胎全能性维持等多种生物学事件。 综上，本研究证实了RNF114作为一个E3泛素连接酶，通过对其下游底物的调控，在早期胚胎发育以及胚胎全能性维持上发挥重要的生物学功能。通过对RNF114的生物学功能和机制的探索，为更加深入了解早期胚胎发育事件和调控机制奠定一定基础，也为提高胚胎体外培养的成功率提供了一些新思路。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R321

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本文编号：2418911