【摘要】：蟾酥是由蟾蜍科两栖爬行动物的耳后腺及皮肤腺分泌物经加工干燥制成,为传统中药材。蟾酥所含甾体类、生物碱等生物活性物质因具有强心、升压、兴奋中枢、镇痛、抗肿瘤等多种功能而被广泛应用。中枢神经系统神经元细胞膜上富含多种离子通道,它们的结构和功能是决定神经元兴奋性及相关生命过程的分子基础。 本研究旨在检测蟾酥活性成分蟾蜍二烯内酯类化合物对中枢神经系统神经元兴奋性的影响,以及其对延迟整流型钾通道的作用机制。主要研究内容与结果如下： (1)检测了两种蟾酥二烯内酯类化合物脂蟾毒配基(Resibufogenin, RBG)和华蟾酥毒基(Cinobufagin, CBG)对于对原代培养的海马神经元兴奋性的影响,以及它们对决定动作电位的电压依赖性钠、钾、钙通道的影响。 对动作电位波形参数的作用结果显示,胞外给予RBG/CBG,能够增加动作电位的峰值和超射值,显著降低动作电位的基强度、动作电位阈值和半峰时程。对重复放电动作电位的作用结果显示,细胞外RBG/CBG的调节作用呈现先增强后抑制的趋势,在短时间内可以提高神经元兴奋性,明显增加细胞重复放电产生的第一个动作电位的动作电位峰值,降低激活阈值；长时间作用反而抑制神经元兴奋性,表现为重复放电过程中后续动作电位峰值降低,膜电位提高,放电频率降低等。细胞外给予1μMRBG/CBG对电压门控钠通道电流有激活作用,明显抑制电压门控钾通道电流,对电压门控钙通道电流无显著影响。 (2)应用全细胞和单通道膜片钳技术,研究了RBG/CBG对原代培养的大鼠海马神经元细胞上的瞬时外向钾电流(IA)和延迟整流钾电流(IK)的调节作用。 RBG在细胞外浓度依赖性的抑制IA及IK的幅度,并且该作用具有电压依赖性。同时,RBG对IK的激活和失活的动力学参数也有显著影响,使IK电流的稳态激活曲线右移,稳态失活曲线左移；RBG对IA的激活过程并无显著影响,却可以显著其影响失活过程,使稳态失活曲线向电压的超极化方向移动。细胞外给予相同浓度的CBG后,对IK的作用效果与RBG相似。CBG可以浓度依赖性的抑制IK的幅度,并且具有电压依赖性；对IK的稳态激活和失活动力学参数也有显著影响,使电流的稳态激活曲线右移,稳态失活曲线左移；但是细胞外给予不同浓度的CBG对IA却没有显著影响。进一步的实验结果表明,细胞内给予1μM RBG/CBG,在不影响通道的电流幅度和电导的情况下,可以影响通道的开放频率,开放时间和关闭时间等通道动力学参数。 (3)使用Autodock软件计算强心苷母核和多种蟾蜍二烯内酯类化合物与哺乳动物中枢神经系统中主要的延迟整流型钾通道亚型Kv1.2和Kv1.2-Kv2.1的相互作用。 以Kv1.2和Kv1.2-Kv2.1为受体,以RBG/CBG等12种蟾蜍二烯内酯类化合物及强心苷母核作为配体,使用Autodock软件进行分子对接实验,预测了药物与通道蛋白的对接区域。对接结果显示：12种药物的盲对接结果呈现了较高的一致性,进一步的对接计算说明盲对接结果可信,由此确定了受体与配体化合物的结合区域。对接结果还显示出配体母核在对接过程中起着重要的作用,配体与受体的结合是极化作用和疏水键作用双重作用的结果。蟾蜍二烯内酯类化合物与Kv1.2和Kv1.2-Kv2.1相互作用活性位点的理论预测将有助于该药物在中枢神经系统中调控兴奋性机制的研究。 (4)采用瞬时转染野生型和突变型Kv2.1钾通道质粒的HEK293细胞为细胞模型,应用全细胞膜片钳技术观察和记录了RBG对野生型和突变型Kv2.1钾通道电流的影响及其调控作用机制。 实验在Kv2.1钾通道电流无明显衰减的条件下进行。RBG可以呈浓度依赖性的抑制Kv2.1钾电流；其抑制Kv2.1钾通道的IC50值为1.17gM；当去极化至+70mV时,1μMRBG可以将Kv2.1电流抑制达对照组的55.29±7.01%；10μM RBG对Kv2.1钾通道的抑制效果接近最大。以TEA为阳性对照药物,1μM RBG和10mM TEA对Kv2.1钾电流的抑制程度接近。RBG可以加速Kv2.1通道稳态激活和失活过程,增加TEA对Kv2.1通道电流的阻断作用,而且这种影响在细胞内外液缺少K+的情况下仍然存在。敲除Kv2.1的C末端,可以去除RBG对Kv2.1通道的调节作用。对于突变型Kv2.1(?)C416,RBG对野生型Kv2.1通道的抑制作用,以及对Kv2.1通道稳态激活和失活特征的影响都消失。提示在Kv2.1(?)C416和Kv2.1(?)C318之间的氨基酸序列是决定RBG与Kv2.1通道结合的关键区域。 综上所述,本文利用电生理等检测方法在原代培养的海马神经元上考察了蟾蜍二烯内酯类化合物对神经元兴奋性的调节作用；利用12种结构相似的蟾蜍甾二烯类化合物与Kv1.2和Kv1.2-Kv2.1两种受体蛋白进行了分子对接研究,得到这些药物分子与通道蛋白相互作用的活性区域；利用转染Kv2.1的HEK293细胞考察了药物对电压依赖型钾通道的影响,并阐述了药物对该类型通道的作用机制。
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【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R338
【参考文献】
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