马耳他布鲁氏菌膜间质蛋白BP26抗原表位筛查与鉴定

发布时间：2019-03-02 17:37

【摘要】：背景：布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病)又称地中海弛张热,马耳他热,波浪热或波状热,是由布鲁氏菌(Brucella,简称布菌)侵入机体后引起的人畜共患传染病。人感染后可引发关节炎、脑膜炎、心内膜炎等,表现为持续性感染且难以治愈。动物感染后可引发公畜睾丸炎和附睾炎,孕畜多数发生流产、早产、死胎等,是造成畜牧业重大损失的主要疾病之一。近年来,该病的发生和流行在世界范围内呈上升趋势。据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)统计表明,全球每年有50万例人布病发生,每年造成的经济损失达30亿美元。根据我国疾病预防控制中心(CDC)的统计显示,我国每年也有35000例人布菌感染病例。布菌为革兰氏阴性,兼性厌氧胞内寄生菌,无芽胞,无鞭毛,有荚膜。目前布鲁氏菌科可分为9个种属：羊种(B. melitensis),牛种(B. abortus),猪种(B.suis),沙林鼠种(B. neotomae),绵羊附睾种(B. ovis),犬种(B. canis),田鼠种(B.microti),鲸型海洋种(B. ceti)和鳍型海洋种(B. pinnipedialis)。我国流行的布病总体上以羊种为主的混合感染,羊种占流行株的85%。布病的预防主要依赖疫苗免疫,减毒活疫苗是目前最为有效的疫苗。羊种布菌疫苗M5-90是我国自主研发用于预防绵羊和山羊的减毒活疫苗,免疫效果比较好。然而,M5-90疫苗株也存在两个缺陷：一是免疫动物与自然感染动物不能区别,严重影响了布病的诊断和检疫；二是疫苗毒力较强,可引起部分孕畜流产。因此,研制一种新型的毒力低、免疫效果好、能进行鉴别诊断的分子标记疫苗势在必行。目前,国内外倾向于采用基因工程的手段对布菌现有疫苗进行改造。国外曾有研究报道了羊种布菌疫苗株Rev.1BP26基因缺失株(CGV26)并发现仍具有免疫保护效果。但是,国内研究人员对M5-90菌株进行改造,敲除BP26得到新的突变株M5Δbp26,其毒力有所下降,但免疫应答弱于原疫苗株,持续时间短,免疫效果达不到要求。由此推断,BP26蛋白可能与疫苗株毒力和保护性抗原相关,若将M5-90疫苗株携带的BP26基因全部敲除,则影响弱毒疫苗株的免疫效果。膜间质蛋白或称周质蛋白BP26(Periplasmic Protein BP26),又称omp28或CP28是布菌的一种外膜间质蛋白,在布菌多数亚种中具有高度的保守性。研究表明,BP26蛋白在感染的牛、绵羊、山羊和人中是一种免疫优势抗原,可作为动物和人布菌感染的诊断抗原,准确率可达到86%以上。因此,我们设想在保留M5-90BP26蛋白的保护性抗原表位前提下,针对BP26蛋白抗原表位及毒力相关位点进行分子修饰或改造,构建分子标记的弱毒疫苗株,建立表位Peptide-ELISA诊断方法,进而解决布鲁氏菌疫苗免疫与野生菌株感染的鉴别诊断技术难题。目的：本研究旨在揭示布菌弱菌毒株B. melitensis M5-90的BP26蛋白B和T细胞抗原表位,最终绘制出M5-90主要蛋白抗原表位及其宿主MHC限制性图谱,为M5-90弱毒疫苗株的基因工程改造提供实验数据支持。材料与方法：实验采用基因原核表达技术,制备M5-90重组BP26(rBP26)蛋白。以rBP26蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,采用鼠脾细胞与骨髓瘤细胞杂交瘤技术制备BP26单克隆抗体。以M5-90菌株提取的含天然BP26的膜蛋白(NMP)为抗原,采用West Blot和ELISA方法测定制备的单克隆抗体的特性；以合成的BP26重叠多肽或突变多肽,采用Peptide-ELISA方法筛查和鉴定单克隆抗体识别的抗原表位。以M5-90免疫羊和疫区羊血清样品,测定筛查出的BP26表位多肽与抗体的反应性,评价与rBP26-ELISA、NMP-ELISA以及常规试管凝集试验(SAT)和虎红平板凝集试验(RBPT)的符合率。采用ELISPOT方法,测定BP26多肽诱导免疫绵羊PBMCs表达特异性IFN-y的水平,初步筛查BP26蛋白T细胞抗原表位。结果： 1.重组BP26蛋白。实验以pET-28a或pET-30a质粒构建了1个表达完整的rBP26(1-250aa)、3个表达截短的rBP26-1(29-250aa)、rBP26-2(48-131aa)和rBP26-3(129-250aa)的重组载体,并在大肠杆菌中进行了诱导表达。经超声破碎细菌后的表达蛋白产物包涵体以盐酸胍溶解、复性和纯化,经SDS-PAGE电泳鉴定纯度在80%以上。 2.BP26单克隆抗体。用复性的rBP26抗原分三次免疫BALB/c小鼠,抗原量分别为100μg、50μg、25μg,效价达1：102400。选择免疫效价高的小鼠,无菌取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。经过一轮亚克隆及3-4轮克隆化对杂交瘤细胞筛选,共获得29株抗rBP26蛋白单克隆抗体(mAb),其中18株IgG1(k)、1株IgG2a(k)、8株IgG2b(k)、1株IgG3(k)和1株IgA(k)。应用疫苗株M5-90膜蛋白提取物(NMP),对29株单抗进行了Western-blot和Dot-ELISA进行分析。结果显示,19株单抗在Western-blot检测时,能与变性的含天然BP26的膜蛋白提取物(NMP)反应；16株单抗在Dot-ELISA检测时,能与非变性的天然BP26蛋白反应；2株单抗仅与rBP26反应而与NMP不反应。另外,以28个BP26重叠多肽测定,11株单抗与合成多肽反应。根据识别BP26抗原的性质,将29株单抗识别的BP26抗原表位分为线型(11株)、构象型(8株)、半构象型(8株)及未分类(2株)四个类型。 3.B细胞线性抗原表位。应用合成的28条重叠多肽(命名为P01-P28,长度11-16个氨基酸,重叠7个氨基酸,覆盖完整BP26蛋白),分别与制备的29株单抗进行Peptide-ELISA测定。结果显示,其中11株单抗能与3条命名为P11、P12和P13的多肽反应。根据与多肽的反应,将11株单抗分为三个组：第一组,与多肽P11反应的为3D7、3H5和4D9；第二组,与多肽P12反应的为2A4、2H9、3H6和5F12；第三组,与多肽P12和P13反应的为5A5、1G1、5812和7C6。分析判定,P11中包含一个抗原表位,P12和P13两者共同包含一个抗原表位。为了进一步区别P12与P11携带的表位,实验合成了P12’(102-117aa)多肽,去掉了P12中与P11重叠氨基酸。为了进一步精确测定抗原表位,针对P11和P12’各合成了各6条9个氨基酸的重叠短肽(分别命名为P1101-P1106或P1201-P1206,重叠8个氨基酸)。从三个组别中分别挑选出一株单抗即3H5、2A4和5A5,以竞争抑制ELISA方法进行验证,结果显示短肽P1104能够抑制单抗3H5与多肽P11反应,P1202、P1203和P1204能够抑制单抗2A4与多肽P12’反应,而P1202-P1206均能抑制单抗5A5与多肽P12’反应,但是P1203与P1204抑制能力明显强于P1202、P1205和P1206。所以,3H5单抗识别的抗原表位核心为93DRDLQTGGI101,2A4和5A5单抗识别同一个抗原表位核心为104QPIYVYPD111在P11和P12’两个表位多肽内各选择了两个位点进行了氨基酸突变,合成了点突变多肽MutP11(D93N和D95N)与MutP12'(Y107F和Y109F)。将突变多肽分别与11株单抗进行Peptide-ELISA反应,结果显示,除2H9及5F12外,9株单抗与突变多肽的反应能力明显减弱或丧失,说明P11或P12’中确实分别包含了一个抗原表位,且突变的位点是构成表位的关键氨基酸。 4.B细胞半构象型和构象型抗原表位区域。为了确定16株单抗识别的半构象型和构象型抗原表位的区域,采用构建的3个截短的rBP26-1(29-250aa)、 rBP26-2(48-131aa)和rBP26-3(129-250aa)重组蛋白,进行Western-blot分析。结果显示,16株单抗均能与BP26蛋白的29-250aa大片段反应,无表位分布在前1-28aa的信号肽部位,5株单抗识别48-131aa区域,1株单抗识别129-250aa区域,1株单抗可识别两个小片段蛋白。 5.B细胞线性抗原表位多肽与羊血清样品的反应性。实验测定了BP26两条线性表位多肽,即93DRDLQTGGI101和104QPIYVYPD111的KLH偶联物,与137份羊血清抗体(117份疫区随机血清,20份免疫血清)的反应性。采用常规布病诊断方法试管凝集试验(SAT)和虎红平板凝集试验(RBPT)为对照,以ELISA方法测定P11-KLH、P12'-KLH、rBP26及NMP对羊血清的反应。通过分析4种抗原抗体反应结果与常规方法(金标准)的符合率,绘制了ROC曲线并确立最优Cutoff值,评价了发现的两个线性表位多肽在布菌感染或疫苗免疫中的抗原反应性。P11-KLH、P12'-KLH两个表位多肽与常规法检测结果的符合率分别为65%及70%,是布菌的两个优势抗原表位。 6.T细胞抗原表位。以植物血凝素(PHA)或刀豆蛋白A (ConA)诱导PBMCs作为阳性对照,以不加多肽刺激物和加入非相关多肽刺激物的PBMCs作为阴性对照,采用ELISPOT方法测定BP26多肽诱导M5-90免疫羊表达特异性IFN-γ的水平。以阴性对照的平均值加上2倍的标准差作为阳性判定的标准,实验初步筛选出了5个多肽表位能够诱导较高水平的特异性T细胞免疫反应,分别为15TIMLVGAFSLPAFAQE30,42VTGEGMMTASPDMAIL57,69REAMTANN EAMTKVLD84,105PIYVYPDDKNNLKEPT120和195LGRVVEISELSRPPMP210。结论： 1、制备了27株可与B.melitensis M5-90弱毒疫苗株BP26天然抗原反应的鼠源单克隆抗体,其识别表位分为线型、半构象型和构象型三类。 2、发现2个BP26B细胞线性抗原表位,分别为93DRDLQTGGI101和104QPIYVYPD111,并证实是B. melitensis感染或疫苗免疫的优势抗原表位。 3、初步揭示了5个BP26特异性T细胞抗原表位,分别为15TIMLVGAFSLPAFAQE30,42VTGEGMMTASPDMAIL57,69REAMTANNEAMTK VLD84,105PIYVYPDDKNNLKEPT120和195LGRVVEISELSRPPMP210,可以特异性诱导产生较高水平的IFN-γ。 4、研究结果为指导M5-90弱毒菌苗株的基因工程改造提供了基础数据。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392

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