WDR26对氧化应激所致心肌细胞mPTP开放的影响及其心肌保护作用研究

发布时间：2019-03-13 08:45

【摘要】：在缺血的基础上恢复血流灌注后,心肌组织损伤反而加重的现象称为心肌缺血-再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury, MIRI).心肌缺血再-灌注损伤常见于冠状动脉搭桥术、心血管栓塞再通、体外循环下行心肺直视手术等。其发生机制与活性氧的产生、钙超载、微血管损伤和能量代谢障碍等有关。过氧化氢,超氧阴离子和羟自由基等活性氧在心肌缺血-再灌注损伤中发挥了重要作用。 WD重复序列是一段包括在甘氨酸-组氨酸(GH)二肽和色氨酸-天门冬氨酸(WD)二肽之间的含有40个左右氨基酸的保守氨基酸片段。这些重复序列可以形成的蛋白结构域被称为WD区域。WDR蛋白家族是包含4-16个WD重复序列的广泛存在于真核生物的一组蛋白。WDR蛋白有着广泛的功能。这些功能包括信号转导、基因转录调控、细胞周期控制、自噬与细胞凋亡等,主要通过形成多蛋白复合物来实现,而且与许多疾病具有密切关系。MDR26(WDrepeat domain26)基因是本实验室研究人员采用生物信息学技术和5’-RACE技术相结合的方法,从大鼠心肌组织中首次克隆的一个在缺血预适应中表达上调的新基因,最初命名为Mipu2(myocardial ischemic preconditioning upregulated protein2)。作为一个在心肌缺血预适应中表达升高的蛋白,是否对心肌缺血-再灌注损伤发挥保护作用,目前尚不清楚。 为了观察WDR26的表达模式,本实验分别采用大鼠心肌缺血-再灌损伤和H9c2心肌细胞氧化应激模型。利用real-time PCR和Western-blot分别检测WDR26的mRNA和蛋白的表达。结果发现,心肌缺血-再灌注损伤中WDR26的(?)nRNA和蛋白水平在缺血再灌注1h和2h后明显增高。H9c2细胞暴露于过氧化氢后,WDR26的mRNA和蛋白水平在2h和4h后明显增高。以上结果表明：心肌缺血-再灌损伤和心肌细胞氧化应激损伤可以使WDR26表达增高。 随后利用Western-blot和激光共聚焦显微镜检测了WDR26的亚细胞定位。Western-blot结果显示WDR26蛋白在线粒体中表达。H9c2心肌细胞瞬时转染WDR26基因后,利用线粒体标记探针Mito-tracker标记线粒体,经激光共聚焦显微镜发现WDR26和线粒体标记存在共定位。这些结果表明,WDR26蛋白定位于线粒体。 为进一步探讨WDR26对心肌损伤的保护作用及其机制,采用WDR26过表达和表达抑制策略观察了WDR26对过氧化氢所致H9c2心肌细胞损伤的影响。结果发现,WDR26过表达可明显抑制过氧化氢引起的心肌细胞坏死和凋亡,WDR26抑制表达后可加重这种损伤作用。此外WDR26过表达可明显抑制过氧化氢引起的Caspase-3和Caspase9活性增加,并且可抑制细胞色素C从线粒体释放到胞浆。以上结果表明：WDR26可抑制过氧化氢引起的心肌细胞坏死和凋亡,其抗凋亡作用可能主要通过抑制线粒体凋亡途径来实现。 由于WDR蛋白主要通过和其它蛋白相互作用来发挥其功能,本研究采用免疫沉淀和蛋白质质谱分析对WDR26相互作用蛋白进行筛选。结果发现有47个蛋白可能与WDR26相互作用。前文证实WDR26能抵抗过氧化氢所致的心肌细胞凋亡,但机制不明。鉴于线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)的开放在细胞凋亡发生中的作用,本研究采用免疫共沉淀技术进一步探讨WDR26与细胞凋亡密切相关的MPTP—蛋白电位依赖性阴离子选择性通道(voltage-dependent anion channel protein, VDAC)和腺苷酸转位子(adenine nucleotide translocator, ANT)的相互作用。结果发现,WDR26与电VDAC和ANT具有相互作用。 为进一步研究WDR26对线粒体膜通透性转换孔开放的影响,本研究采用WDR26过表达的H9c2心肌细胞,经过氧化氢处理后观察细胞线粒体膜电位的变化,并分离上述细胞的线粒体,经钙离子刺激后检测线粒体的肿胀。结果表明WDR26过表达可以明显抑制过氧化氢引起的心肌细胞线粒体膜电位下降和钙离子引起的线粒体肿胀。 综上所述,WDR26作为一个在心肌中新发现的蛋白,对心肌缺血-再灌注损伤和心肌氧化应激损伤发挥重要的保护作用。心肌缺血-再灌损伤及氧化应激损伤中WDR26的表达明显增加。WDR26通过与线粒体膜通透性转换孔蛋白VDAC和ANT发生相互作用,抑制线粒体通透性转换孔的开放和线粒体凋亡信号转导通路的激活,从而减轻氧化应激所致的心肌细胞损伤。 上述研究揭示了WDR26对心肌损伤的保护作用,发现了两个WDR26相互作用蛋白VDAC和ANT,并从蛋白质相互作用角度,首次揭示了WDR26心肌保护作用的分子机制。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

【共引文献】

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本文编号：2439247