促甲状腺素受体（TSHR）的表达在脂肪细胞分化中的作用及其与肥胖症的关联

发布时间：2019-03-27 20:19

【摘要】：肥胖症是指由于体内脂肪蓄积过多或者分布不均匀而导致的一种病状,它是由于机体能量的摄入量长期超过消耗量,进而导致体重增加的一种疾病。研究显示,肥胖症可以引发机体多种疾病,或者增加机体多种疾病的发病率,如冠心病、高血压及心血管疾病等。预防和控制肥胖是避免多种代谢疾病的关键。 研究发现,肥胖症的发生是生理、生化及生活方式等多个因素共同作用的结果。脂肪组织在肥胖症的发生及发展过程中起着非常重要的作用。脂肪细胞分化是正常体内脂肪贮存的生理基础,也是肥胖发生的病理基础。肥胖的核心环节在于脂肪细胞的过度分化与体积的增大,生成了过多功能失调的脂肪细胞。因此,脂肪细胞生长、发育、分化及凋亡的分子调控机制正成为肥胖及其相关疾病研究的热点。 脂肪细胞起源于中胚层的多能干细胞,该多能干细胞是成骨细胞、软骨细胞、肌细胞及脂肪细胞的共同前体细胞。虽然目前决定该多能干细胞定向分化成为脂肪前体细胞的具体机制尚未明确,但是,人们得知该多能干细胞能够在特定条件下定向分化为脂肪前体细胞,进而分化为成熟脂肪细胞。脂肪前体细胞分化为成熟脂细胞的具体调控机制也没完全清楚,但已有不少报道。研究证明,脂肪细胞分化成熟的过程实际上是一系列脂肪细胞特异性基因差次表达的复杂过程。 促甲状腺素受体(Thyroid-stimulating hormone receptor, TSHR)在甲状腺以外组织的表达,包括在脂肪组织中的表达,已经得到证实,且发现它是具有一定的生物学功能的。但是,关于TSHR在脂肪前体细胞分化为成熟脂肪细胞中的具体作用尚未明确,关于TSHR与肥胖症之间的关联报道甚少。因此,进一步深入探讨TSHR在脂肪形成过程中的调控作用、分子机制及其与肥胖症的关联对于临床预防和控制肥胖症意义重大。实验工作分以下三部分开展： 第一部分促甲状腺素受体(TSHR)的表达在脂肪细胞分化中的动态变化及作用 研究目的：探讨促甲状腺素受体(Thyroid-stimulating hormone receptor, TSHR)的表达在脂肪前体细胞3T3-L1和3T3-F442A体外分化为成熟脂肪细胞过程中的动态变化及作用。 研究内容： 1、借助于细胞培养技术,以体外培养的脂肪前体细胞3T3-L1和3T3-F442A为实验材料,诱导分化为相应的成熟脂肪细胞。用油红O染色法鉴定脂肪细胞内甘油三酯的形成,并经异丙醇萃取后于紫外分光光度计下检测汕红O在510nm处的吸光度值。 2、收集诱导分化不同时间(第0,2,4,6,8,10及12天)的脂肪细胞,分别进行RNA及蛋白质的提取,以反转录-聚合酶链式反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)和蛋白印迹技术(Western Blot)检测脂肪细胞分化标志分子过氧化物酶体增殖因子活化受体γ (peroxisome proliferator-activated receptor y, PPAR y)和脂肪细胞脂类结合蛋白(adipocyte lipid binding protein, ALBP)在脂肪细胞形成过程中mRNA及蛋白质表达水平的变化。 3、以上述所获得的诱导分化不同时期的脂肪细胞RNA及蛋白质为材料,用RT-PCR和Western Blot技术检测Tshr在脂肪细胞形成过程中mRNA及蛋白质表达水平的变化。 4、借助于免疫荧光细胞化学法,采用倒置相差荧光显微镜检测脂肪前体细胞及成熟脂肪细胞内Tshr的表达情况。 5、设计靶向小鼠Tshr基因的shRNA序列,构建重组慢病毒载体LV3/Tshr-shRNA(以LV3/NC为阴性对照),经293T细胞包装病毒后感染脂肪前体细胞3T3-F442A,筛选出稳定干扰Tshr蛋白表达的3T3-F442A单细胞克隆,以油红O染色、RT-PCR及Western Blot技术检测Tshr表达变化对脂肪前体细胞体外诱导分化敏感性的影响。 6、用不同浓度(0,0.125,0.25,0.5,1.0,2.0μM)牛促甲状腺素(bovine thyroid-stimulating hormone, bTSH)刺激3T3-F442A脂肪前体细胞以及其相应的成熟脂肪细胞,检测细胞内环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)含量的变化。 7、用两种浓度的bTSH (0.2μM,2μM)刺激处于诱导分化过程中的脂肪前体细胞3T3-F442A,检测bTSH对胰岛素诱导的脂肪细胞分化过程的影响,并分析其可能的机制。细胞分为四组：第一组：对照组,细胞培养在10%胎牛血清-DMEM (10%FBS-DMEM)培养基中,每2-3天更新培养基一次,不作其他任何处理；第二组：诱导分化组,细胞按照实验方法中所述进行诱导使其向成熟脂肪细胞分化；第三组：bTSH低浓度(0.2μM)作用组,细胞按照实验方法中所述进行诱导使其向成熟脂肪细胞分化,在加入诱导分化因子的同时加入bTSH至终浓度0.2μM；第四组：bTSH高浓度(2μM)作用组,细胞按照实验方法中所述进行诱导使其向成熟脂肪细胞分化,在加入诱导分化因子的同时加入bTSH至终浓度2μM。对上述四组处于诱导分化不同时间(第0,2,4,8,12,14,16天)的细胞进行油红O染色,异丙醇萃取后检测510nm吸光度值的变化,对比同期诱导分化的不同处理组细胞间的甘油三酯生成含量。收集上述四组细胞诱导分化不同时间(第2,4,8,12,16天)的蛋白进行Western Blot检测,检测ERK及JNK磷酸化水平变化,以分析bTSH对脂肪细胞分化的影响机制。 8、使用两种浓度的bTSH (0.2μM,2μM)刺激3T3-F442A成熟脂肪细胞,检测bTSH对胞外信号调控激酶(external-signal regulated kinase, ERK)及c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)磷酸化水平的影响,以期明确Tshr在脂肪细胞分化中的信号转导通路。 研究结果： 1、光镜下可见3T3-L1和3T3-F442A脂肪前体细胞呈成纤维细胞样贴壁生长,细胞内没有甘油三酯聚积,油红O染色不着色。脂肪前体细胞经过体外诱导分化后,可见脂肪前体细胞形态逐渐变圆,胞浆内开始出现脂滴,为油红O染色着色,且随着分化程度的增强,脂滴逐渐变大且增多,油红O染色着色加深,OD510nm检测结果也显示吸光度值随细胞诱导分化程度的增强逐渐增加,至诱导分化第12天可见90%以上细胞呈脂肪细胞表型,大量脂滴聚积。 2、RT-PCR和Western Blot检测结果发现在脂肪细胞诱导分化过程中,PPARγ和ALBP mRNA及蛋白质表达水平随分化程度的增强逐渐升高,与未分化组细胞(诱导分化第0天)相比较,自诱导分化第4天始,每个时间点皆明显升高,且差异具有统计学意义(P0.05)。 3、在脂肪细胞诱导分化过程中,Tshr蛋白质表达水平随细胞分化程度的增强逐渐升高,与未分化组细胞(诱导分化第0天)相比较,3T3-L1自诱导分化第4天后都明显升高,且差异具有统计学意义(P0.05)；3T3-F442A在诱导分化后第2天出现一个表达的小峰值(P0.05),随后自诱导分化第4天表达水平逐渐增加且差异具有统计学意义(P0.05)。 4、免疫荧光细胞化学法检测结果显示,3T3-L1和3T3-F442A成熟脂肪细胞内Tshr蛋白质表达水平显著高于对应的脂肪前体细胞。 5、对筛选出的靶向干扰Tshr表达的3T3-F442A脂肪前体细胞单克隆进行RT-PCR和Western Blot检测,发现我们所选Tshr siRNA序列能够有效干扰Tshr mRNA及蛋白质的表达,其中mRNA干扰程度为(60.73±5.56)%,蛋白质干扰程度为(71.33±7.02)%。体外诱导分化实验结果发现,干扰Tshr表达降低了脂肪细胞分化成熟的程度,与未干扰组及阴性对照组细胞相比较,干扰Tshr表达组细胞在诱导分化第12天表现出显著降低的OD510nm值(P0.05),且同期的PPARy和ALBP mRNA及蛋白表达水平较空载体组细胞有所下调,尤其是诱导分化14天,下调显著,差异具有统计学意义(P0.05)。 6、用不同浓度bTSH (0,0.125,0.25,0.5,1.0,2.0μM)刺激3T3-F442A脂肪前体细胞以及其相应的成熟脂肪细胞,发现随着bTSH浓度增加cAMP含量增加,表明脂肪前体细胞和脂肪细胞上的Tshr均有受体信号转导的特性或生物学功能。 7、用bTSH (0.2μM,2μM)刺激处于诱导分化过程中的3T3-F442A脂肪前体细胞,发现引入bTSH (0.2μM,2μM的实验组中脂肪细胞分化成熟的速度较同期下降,尤其是分化第12天,与单纯诱导分化组相比,油红O含量(OD510nm)下降显著,差异具有统计学意义(P0.05)。且bTSH(0.2μM,2μM)对胰岛素引起的ERK和JNK的磷酸化水平有所降低,提示bTSH在脂肪细胞体外分化过程中有一定的抑制作用,其机制可能与干扰胰岛素信号通路(如JNK, ERK磷酸化)有关。 8、用bTSH (0.2μM,2μM)刺激成熟的3T3-F442A脂肪细胞,发现JNK, ERK的磷酸化水平均增加,下游靶分子c-Jun磷酸化水平也增加,尤其在bTSH(2μM)刺激组内,JNK, ERK磷酸化水平增加显著(P0.05),说明在成熟脂肪细胞中bTSH可激活ERK与JNK信号转导通路。 研究结论： 通过本部分实验的实施我们得出以下结论： 1、在3T3-L1和3T3-F442A脂肪前体细胞体外分化过程中,Tshr表达随着分化程度的加重而逐渐升高； 2、干扰3T3-F442A脂肪前体细胞中Tshr的表达,其体外分化过程受到一定程度的抑制； 3、较高浓度的bTSH刺激能够抑制脂肪细胞的早期分化,其机制可能与干扰胰岛素信号通路(如JNK, ERK磷酸化)有关。第二部分促甲状腺素受体(TSHR)的表达与肥胖症的关联 研究目的：探讨促甲状腺素受体(TSHR)的表达与肥胖症的关联。 研究内容： 1、建立肥胖症动物模型实验： 选用8周龄雄性C57/BL6小鼠为实验材料,随机分为两组,以基础饲料(脂肪含量5%)喂养组为对照组,用高脂饲料(脂肪含量20%)喂养组为模型组,建立肥胖症动物模型。每周称量动物体重一次。模型组动物体重比对照组增加30%以上视为肥胖症模型造模成功。 造模成功后,经深度麻醉对动物进行眼球取血,离心获取血清,检测血清中总胆固醇(cholesterol, CHOL)、甘油三酯(triglycerides, TG)、血糖(glucose, GLU)及谷草转氨酶(aspartate transaminase, AST)的含量。取动物内脏脂肪组织(肾周脂肪组织)进行蛋白质的提取和Western Blot检测,分析Tshr在不同肥胖体征动物中的表达变化。 2、临床不同肥胖体征患者脂肪组织中Tshr的表达水平检测： 临床样本来自在山东大学附属省立医院耳鼻咽喉头颈外科住院、经病理学或相关影像学检查为良性病变的患者。经患者术前知情同意并经山东大学医学院伦理委员会同意后,收集手术过程中在手术视野内的赘余脂肪组织。按照个体体重指数(body mass index, BMI)大小将上述患者分为四组：偏^俗，

本文编号：2448527