组蛋白去乙酰化酶1调节间充质干细胞向心肌谱系转分化

发布时间：2019-03-28 08:06

【摘要】：目的检测心肌微环境下,骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌细胞(CM)转分化过程中组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)的时相表达,初步探讨成体干细胞定向转分化的乙酰化调控机制。方法 1.采用全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs),当细胞达80-90%融合时,用胰酶-EDTA(0.25%:0.05%)消化细胞进行传代培养。取第3代细胞进行流式细胞术细胞表面标记检测,并诱导BMSCs向成骨细胞、成脂肪细胞分化。茜素红染色鉴定BMSCs成骨分化的能力,油红O染色鉴定BMSCs成脂肪分化的能力。 2. 293A细胞培养,当细胞达50-70%融合时,用0.25%胰酶消化细胞,以1:10-1:20传代扩增培养。 3. Ad-EGFP以MOI 100转染90-100%融合的293A细胞进行病毒扩增,转染3天后,细胞出现病变效应,收集细胞。 4. Ad-EGFP以MOI 0、10、50、100、200、400转染BMSCs,流式细胞术检测转染效率,并得出最佳转染效率的MOI值。 5.新生乳鼠心肌细胞(cardiomyocytes,CM)分离、培养,72 h后免疫荧光染色法鉴定心肌肌钙蛋白T(CTnT)的表达情况。 6.将Ad-EGFP转染后的BMSCs与CM以1:1比例直接接触共培养。 7.依据共培养的时间,将实验分为六组,即BMSCs组(空白对照组)、共培养3天、6天、9天、12天组、心肌细胞(CM)组,收集细胞(1×107),流式细胞仪488 nm波长分选EGFP+BMSCs。 8.免疫荧光染色法检测EGFP+BMSCs中心脏肌钙蛋白T(CTnT)的表达。 9. FQ-PCR检测组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase 1,HDAC1)的mRNA表达。 10. Western Blot检测组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)的蛋白表达。 11.数据分析采用SPSS 13.0统计软件,数据用均数±标准差( x±s)表示,两组间比较采用独立样本t检验,多组之间比较采用单因素方差分析,P0.05为差异有统计学意义。结果 1.原代及传代的骨髓间充质干细胞均呈成纤维细胞样的长梭形,第3代骨髓间充质干细胞不表达造血标志CD34(3.04%)、CD45(1.14%) ,强表达CD29 (99.86%)、CD44 (99.28%)、CD90(99.74%)等基质细胞/间质细胞表面标志。成骨诱导21 d后,可见大量橘红色矿化结节形成。成脂诱导2-3周后,可见细胞的胞浆内出现大量红染脂滴。 2. 293A细胞贴壁后呈成纤维细胞样,Ad-EGFP转染293A细胞第3天,细胞变圆、脱落,呈葡萄串样聚集,荧光显微镜下观察,293A细胞发出绿色荧光。 3. EGFP在Ad-EGFP转染BMSCs 24 h后开始表达,72 h后达到峰值。MOI 10-100时,转染效率不足60%;MOI 400时,转染效率达80-85%,但BMSCs出现细胞病理效应(CPE);MOI 200时,细胞无明显形态改变,转染效率近80%。 4.心肌细胞分离培养24 h后出现自主收缩,呈三角形或扁平不规则形,72 h后,免疫荧光染色提示心脏肌钙蛋白T(CTnT)阳性率达90%以上。 5. BMSCs与CM共培养2-3天后,可见与CM直接接触的长梭形BMSCs逐渐缩短、增粗,4-5天后荧光显微镜下显示部分EGFP+BMSCs表达CTnT,12天后终止共培养实验,未见EGFP+BMSCs自发搏动。流式细胞术检测分选的EGFP+BMSCs阳性率可达97%以上。 6. HDAC1 mRNA在各组标本均有表达,在共培养3天、6天、9天、12天4个时点组和CM组中的表达量均显著低于对照(BMSCs)组,P0.05,BMSCs组中的HDAC1 mRNA的表达量约是CM组的14倍。 7.与对照组(BMSCs组)比较, HDAC1蛋白的表达水平在共培养3天、6天、 9天组有明显降低(P0.05),BMSCs组中HDAC1蛋白的表达量约是CM组的8倍。结论HDAC1负性调节微环境下BMSCs向心肌细胞的转分化。
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【学位授予单位】：广州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R329

【参考文献】