色素上皮衍生因子在慢性高糖诱导的胰岛β细胞氧化应激损伤中的作用

发布时间：2019-04-02 10:34

【摘要】：目的慢性高糖会对机体的组织和器官造成损害，，包括胰岛β细胞。近年来“糖毒性学说”收到广泛关注，认为：长期暴露在高浓度的葡萄糖条件下胰岛β细胞的胰岛素分泌功能下降，胰岛β细胞减少，且呈不可逆性改变。研究表明其机制是高糖诱导胰岛细胞胞内氧化应激而造成胰岛β细胞氧化损伤。PEDF是一种内源性抗氧化应激分子。近年来国内外多项研究显其与氧化应激相关的疾病如：代谢综合症，腹型肥胖，糖尿病肾病等关系密切，一些基础研究也表明PEDF可在多种细胞中通过不同途径发挥其抗氧化应激性能，对细胞产生保护作用。然而在胰岛细胞中的研究未见报道，本研究旨在明确、探讨：1）不同糖浓度孵育，对INS-1E细胞内ROS的产生、细胞活性、细胞凋亡率及糖刺激的胰岛素分泌功能的影响；2）PEDF是否能够改善高糖诱导的INS-1E细胞氧化损伤。材料与方法 1）INS-1E细胞种盘次日，以无糖PRMI1640培养基饥饿细胞2h，按葡萄糖浓度分为5.6mmol/l组（对照组），16.7mmol/l组，30mmol/l组，并以甘露醇（mannitol）调节渗透压，即5.6mmol/l glucose+24.4mmol/l mannitol、16.7mmol/lglucose+13.3mmol/l mannitol、30mmol/l glucose，分别用5.6G、16.7G、30G表示。三个梯度糖浓度培养基处理细胞48h后，DCFH-DA探针检测细胞内ROS含量；MTT法检测细胞活性；PI/Hoechst法检测细胞凋亡率；GSIS（去培养基→清洗细胞→2.5mmol/l glucose的KRBH平衡30min→清洗→16.7mmol/l glucose的KRBH刺激30min）处理、收集上清，ELISA检测葡萄糖刺激的胰岛素分泌。比较不同浓度高糖处理对以上指标的影响。 2）RT-PCR检测大鼠肾、胰岛、腺泡及INS-1E细胞内PEDF mRNA水平。 3）构建PEDF质粒，在INS-1E细胞内脂质体转染PEDF质粒并检测其蛋白表达，确定转染是否成功。 4）细胞种盘次日转染，分组为：5.6G、16.7G、30G三组，同一糖浓度根据转染质粒的不同分为GS(glucose+scramble)，GP（glucose+PEDF）两组，即5.6GS，5.6GP，16.7GS，16.7GP，30GS，30GP六组。转染后24h（PEDF蛋白表达高峰）对细胞进行2h饥饿处理，其后分别用三种糖浓度培养液孵育细胞48h，同上方法检测，比较同一糖浓度组内，GP与GS组细胞内ROS含量、细胞活性、凋亡率及GSIS差异。（scramble以空质粒载体替代）结果 1）高糖（16.7G、30G）培养基处理48h后INS-1E细胞胞内ROS含量、细胞凋亡率显著增加，细胞活性、胰岛素分泌功能显著降低，并呈浓度依赖性。 2）在大鼠肾、胰岛、腺泡及INS-1E细胞内，PEDF的mRNA水平差异显著，其中INS-1E细胞内其mRNA微乎其微。 3）以2ug PEDF质粒转染INS-1E细胞，其24、48、72h蛋白过表达均较显著，过表达有效。 4）较之16.7GS、30GS组，对应的16.7GP、30GP组细胞内ROS含量、细胞凋亡率显著降低，细胞活性、 GSIS显著改善，均具统计学意义。5.6mM糖浓度组，PEDF转染对上述指标无显著影响。结论本研究初步揭示了高糖可致INS-1E细胞内ROS含量增加，并伴随着细胞凋亡增加、细胞活性及胰岛素分泌功能逐渐降低，并具有浓度依赖性特征；高糖状态下（16.7G、30G），过表达PEDF可显著降低INS-1E细胞内ROS的生成及细胞凋亡率，增加细胞活性及其胰岛素分泌功能，PEDF可改善高糖状态下细胞的氧化应激损伤。
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【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

【共引文献】