拉伸刺激对脂肪源干细胞成骨诱导的影响

发布时间：2019-04-03 14:50

【摘要】：背景原林教授提出的“筋膜学假说”认为人体是由尚未分化的非特异性结缔组织(筋膜)支架所构成的支持与储备系统和以已分化功能细胞为基础的功能系统所共同构成。功能系统在支持与储备系统支持下维持结构与功能的稳定,支持与储备系统不断的为功能系统的细胞更新和功能活动提供源源不断的细胞源泉和细胞活动所需要的营养物质。功能系统是建立在功能细胞的专能特化基础上的,而支持与储备系统的筋膜支架是以干细胞为核心,通过分化出各种定向干细胞,为功能系统的更新提供源源不断的细胞补充,并为功能系统的各种细胞的更新、代谢提供一个稳定的内部环境。间充质干细胞(menchymal stem cells)具有自我更新、多向分化的能力。最初是由Friendenstein等发现,且证明其在体外可以分化成为成骨细胞及脂肪细胞,而后其它的研究小组发现骨髓来源的MSCs不仅可以分化为中胚层来源的组织,而且可以分化为内胚层和外胚层来源的组织。间充质干细胞的多组织来源与筋膜结缔组织支架的全身分布是一致的,其纵向、横向分化的生物学特性与筋膜学提出的筋膜结缔组织对机体的支持储备作用也是一致的。ADSCs是筋膜中未分化干细胞的一种储备形式。ADSCs具有多分化潜能,能够跨胚层分化。ADSCs具有低免疫原性,免疫调节功能和分泌细胞因子等能力为异体移植提供了有利条件,使ADSCs成为生物治疗的亮点之一；ADSCs分泌细胞因子抗老化的作用,已经被临床广泛应用。ADSCs不仅可以用来进行各种退行性和衰竭疑难病的替代治疗,而且可用来进行辅助的免疫治疗。ADSCs可能通过以下机制修复或者重建组织：首先,ADSCs被植入一个受损的或是坏死的组织,它们能以副分泌的方式分泌出细胞活素和生长因子以刺激修复。ADSCs可以提供抗氧化剂、自由基清除剂、热休克蛋白等给待修复组织,从而清除局部环境中所释放的有毒物质,促进仍存活的细胞的修复。另外,ADSCs可以通过刺激内生性干细胞补充到待修复的脏器或自身直接迁移补充到待修复区域,以调节干细胞的微环境,并且促进它们沿着需要的方式分化为功能细胞,从而更新机体衰老的功能细胞,维持机体平衡。组织和细胞的生理行为是受到物理刺激和化学因素等调控的。对骨组织的研究表明,适宜的力学刺激可引起骨质量和骨密度的增加,而长期的失重或卧床则能导致骨质量的损失。此外由于在不同的力学条件下,骨细胞数量和基质合成能力发生变化、从而引起骨的内部结构改变。许多离体实验已证实,应力的种类、频率、大小和时间等诸多因素都会影响成骨细胞的生化响应。目的 1、分离培养SD大鼠的ADSCs,并进行表面标志CD11b、CD2、CD45、CD49d、CD90和CD106的检测,进行成骨成脂诱导检测多向分化能力。 2、对SD大鼠和Wistar大鼠的腹股沟皮下脂肪垫进行ADSCs体外分离培养,并进行成脂肪诱导和成骨诱导分化,比较2种常用大鼠ADSCs的诱导分化能力,为进一步利用ADSCs进行相关研究和应用提供依据。 3、为了探讨拉伸刺激对ADSCs增殖和生长的影响,本实验应用计算机控制的Flexcell FX-5000柔性基底加载系统探讨低频率拉伸刺激对ADSCs成骨定向诱导过程的增殖动力学变化,为深入研究力学信号对ADSCs增殖、生长、分化等的调控提供初步的实验资料。方法 1、取成年大鼠腹股沟脂肪垫,酶消化法分离、培养筋膜结缔组织脂肪源干细胞。通过形态学、功能学、流式细胞术鉴定非特异性筋膜结缔组织源细胞是否符合间充质干细胞的特性,以判断非特异性筋膜结缔组织中是否含有间充质干细胞。 2、无菌条件下取SD大鼠和Wistar大鼠腹股沟脂肪垫,分离培养脂肪源干细胞。分别取两种来源的第4代ADSCS进行成骨和成脂诱导分化。 3、取第4代ADCSs接种于被Ⅰ型胶原的Bioflex 6孔培养板上,用骨诱导培养基培养；拉伸组和实验对照组均分别每天拉伸加载刺激,其余时间放在同一普通培养箱进行培养,空白对照组不进行拉伸刺激和成骨诱导。分别在2d、4d、8d、16d加载后酶标仪法检测各组ADSCs的碱性磷酸酶(AKP)活性。分别在2d、4d、8d、16d加载后各组培养孔碱性磷酸酶(AKP)重氮盐法染色。结果 1、非特异筋膜结缔组织源细胞具有长梭形、多角形的形态学特征,可以形成细胞集落,体外诱导可以分化成成骨细胞、脂肪细胞。 2、两个种属的大鼠均能获得ADSCs,原代细胞和传至4代细胞在倒置显微镜下观察,形态无明显差异。对SD大鼠和Wistar大鼠腹股沟脂肪垫第4代的ADSCs进行成骨和成脂诱导分化,经诱导后都能向成骨细胞和脂肪细胞转化。 3、牵拉后第2天细胞的AKP活性即高于空白对照组。随着细胞数目的增加,AKP活性相应增强,细胞数目达高峰后；AKP活性趋于平稳。拉伸组碱性磷酸酶染色阳性细胞在拉伸刺激后明显多于实验对照组,但随着诱导时间的延长,拉伸组AKP染色阳性细胞的数目与实验对照组变得接近,但均高于空白对照组。结论 1、筋膜结缔组织脂肪源干细胞具有长梭形、多角形的形态学特征,可以形成细胞集落,与其它组织来源间充质干细胞无明显差别；细胞表面标记物检测中,4代贴壁ADSCs特异性表面标志物CD90、CD29表达率分别为90%以上,而CD49d、CD11b、CD45阴性表达,而CD106弱表达阳性；该细胞经定向诱导后可以成骨、成脂肪,与间充质干细胞多向分化的功能一致。可以判断在发育成熟大鼠的筋膜结缔组织中存在未分化间充质干细胞。 2、从SD大鼠和Wistar大鼠腹股沟脂肪垫获取的ADSCs均具有向成骨和成脂肪分化能力,从两种品系大鼠皮下能获得稳定的原代ADSCs后,均能迅速扩增获得大量成体干细胞,采用SD大鼠或者Wistar大鼠获取ADSCs均是可行的。 3、拉伸应力刺激能促进体外培养ADSCs向成骨方向分化的激活、增殖及碱性磷酸酶的分泌,也就是说拉伸应力可以促进ADSCs向成骨方向分化。拉伸组碱性磷酸酶染色阳性细胞在拉伸刺激后明显多于对照组,但随着诱导时间的延长,拉伸组AKP染色阳性细胞的数目与实验对照组逐渐接近,但均高于空白组,具有显著性差异。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R329

【参考文献】