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肺炎链球菌HMG-CoA还原酶的性质研究及抑制剂筛选

发布时间:2019-04-12 18:08
【摘要】:肺炎链球菌是引起脑膜炎、败血症、肺炎等疾病的主要病原菌,全球每天由于这种病菌而死亡的人数达到了约3700人,其中大多数为抵抗力较弱的儿童。并且由于环境的污染,抗生素的大量不良使用等原因已经使得肺炎链球菌对传统抗菌药物的抗性增强,所以寻找新的靶标及抗生素意义深远。 类异戊二烯在自然界中非常常见,它具有很多重要的生物功能,所以研究类异戊二烯的形成途径,寻找合适的靶标吸引了很多研究者的注意。在生物体内,类异戊二烯的生成有两种途径,一种为甲羟戊酸途径,另外一种为非甲羟戊酸途径。在肺炎链球菌中,异戊二烯的合成主要采用甲羟戊酸途径。我们选取的靶标是甲羟戊酸途径中的3羟基3甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR),功能是催化3羟基3甲基戊二酰辅酶A还原生成甲羟戊酸,是甲羟戊酸形成过程的限速酶。我们的研究主要从下面几个方面进行: (1)根据已有的假单胞菌的HMGR晶体结构,同源模建出肺炎链球菌的晶体结构用于筛选可能的靶标化合物,我们筛选出了D7S系列化合物和LH系列化合物。 (2)对虚拟筛选出来的化合物进行生物活性测试。实验结果证明D7S系列的化合物对HMGR的抑制作用比较明显,IC50在几十个微摩尔。抑制效果最好的化合物D7S21的IC50为11.3μM. (3)为了找出抑制效果较好的化合物的结合位点,我们将化合物对接到模建的蛋白结构中。对接的结果显示化合物与蛋白的结合位点是K263、N212、H378。这几个位点中H378是重要的催化残基,而K263即使重要的催化位点也是重要的结合位点,而N212A是辅因子NADPH的重要结合位点,所以我们推测原因是化合物占据了部分底物和辅因子的活性位点,阻碍了底物和辅因子与酶的结合从而抑制酶的活性。我们采用了结合位点突变体酶活测试和突变体蛋白荧光猝灭两种方法进行验证对接的结果。 (4)结合位点的突变体中有活性的只有Q382A和结合位点N212D有活性。Q382的主要作用是稳定既是重要催化位点也是化合物重要结合位点的氨基酸残基H378,但是自身与化合物并没有直接相互作用。N212是辅因子NADPH的重要的结合位点,同时也是化合物的结合位点,突变成A则失去活性,所以突变成D,保留一部分活性和结合能力。测试结果表明相比较于野生型,作为代表的化合物D7S21和D7S14对Q382A和N212D的抑制作用有所减弱,对Q382A的IC50增大了2倍,对N212D的IC5o增大了3倍。 (5)由于其它一些结合位点的突变体,如K263A、H378A、N212A都失去生物活性,所以我们用荧光猝灭的方法加以验证。荧光猝灭结果显示突变体与化合物的结合能力均比野生型要差,突变体与化合物的结合常数都大幅减小,其中结合能力最差的是Q382A和K263A,结合常数从野生型的14×104M-1降到了1.3×104和0.95×104M-1,降低了一个数量级。 由酶活和荧光的数据结果显示N212、H378、K263是化合物的重要结合位点,抑制剂很有可能是通过与这些结合位点的结合而阻碍底物和辅因子的结合而实现抑制酶活。
[Abstract]:......
【学位授予单位】:华中师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R378

【参考文献】

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本文编号:2457251


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