人骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化条件的优化和生物安全性研究

发布时间：2019-04-13 16:29

【摘要】：目的:探讨人骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的高效诱导体系,为应用人骨髓间充质干细胞高效向成骨细胞分化提供技术指导和理论依据。方法:应用密度梯度离心法分离和培养人骨髓间充质干细胞,采用MTT法对体外扩增的第一代、第二代细胞描绘生长曲线,观察细胞在培养过程中的动态增殖变化。第二代细胞经流式细胞仪检测细胞膜上抗原CD14、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105的表达情况,鉴定是否为人骨髓间充质干细胞。按照培养液中地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的不同浓度分为4组,并设立空白对照组。诱导1组为地塞米松1×10~(-9) mol/L、β-甘油磷酸钠1×10~(-3) mol/L、维生素C 3×10~(-4) mol/L;诱导2组为地塞米松1×10~(-8) mol/L、β-甘油磷酸钠1×10~(-3) mol/L、维生素C 3×10~(-4) mol/L;诱导3组为地塞米松1×10~(-8) mol/L、β-甘油磷酸钠1×10~(-2) mol/L、维生素C 3×10~(-4) mol/L;诱导4组为地塞米松1×10-7 mol/L、β-甘油磷酸钠1×10~(-2) mol/L、维生素C 3×10~(-4) mol/L。加入上述药物诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化,培养10天后应用碱性磷酸酶钙钴法染色检测其分化的成骨细胞的成骨情况,筛选诱导效率最高的诱导体系。结果:在细胞接种后1～3天,第一代细胞数量下降,接着在第4～10天细胞生长进入对数生长期,然后进入平台期。第二代细胞在接种后1～2天,细胞数量下降,第3～10天细胞生长进入对数生长期,然后进入平台期。用流式细胞仪检测培养的第二代细胞细胞膜表面标志抗原为CD44、CD90、CD105阳性,CD14、CD34、CD45阴性,说明培养的细胞为骨髓间充质干细胞。对第二代细胞加入诱导培养液继续培养10天后应用碱性磷酸酶钙钴法染色,分析其积分光密度值为:诱导1组积分光密度值均数为634500.14;诱导2组积分光密度值均数为716254.91;诱导3组积分光密度值均数为808213.05;诱导4组积分光密度值为577479.49;空白对照组积分光密度值均数为177411.99。经非参数秩和检验,4个诱导组分别与空白对照组比较差异有显著统计学意义(P0.01)。4个诱导组之间比较为诱导3组与其它3个诱导组比较差异有统计学意义(P0.05)。结论:采用密度梯度离心分离和培养的方法,可以获得较纯的人骨髓间充质干细胞;经检测特定的细胞表面标志物CD14、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105证实培养的第二代细胞为人骨髓间充质干细胞。研究结果表明由地塞米松1×10~(-8) mol/L、β-甘油磷酸钠1×10~(-2) mol/L、维生素C 3×10~(-4) mol/L组成的诱导体系,诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的效率最高。目的:研究人骨髓间充质干细胞在本研究所采用的体外成骨诱导培养条件下,细胞是否有致瘤性,以及染色体核型是否有异常的变化,分析人骨髓间充质干细胞在体外成骨诱导培养条件下的生物安全性。方法:按照地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的不同浓度组合分为4组,并设立阴性对照组和阳性对照组。诱导1组为地塞米松1×10~(-9) mol/L、β-甘油磷酸钠1×10~(-3) mol/L、维生素C 3×10~(-4) mol/L;诱导2组为地塞米松1×10~(-8) mol/L、β-甘油磷酸钠1×10~(-3) mol/L、维生素C 3×10~(-4) mol/L;诱导3组为地塞米松1×10~(-8) mol/L、β-甘油磷酸钠1×10~(-2) mol/L、维生素C 3×10~(-4) mol/L;诱导4组为地塞米松1×10~(-7) mol/L、β-甘油磷酸钠1×10~(-2) mol/L、维生素C 3×10~(-4) mol/L;阴性对照组为人真皮成纤维细胞接种在裸小鼠皮下;阳性对照组为CNE~(-2)细胞接种在裸小鼠皮下。MSCs第3次传代培养10天后,按照实验分组进行处理后,继续培养10天后,收获细胞并接种在裸小鼠的皮下,10周后观察接种部位是否有可疑肿瘤或结节。应用染色体G显带处理方法分析诱导实验各组人骨髓间充质干细胞的核型,观察诱导后的染色体是否发生倒位、易位、缺失、复制或融合等畸变。结果:4个诱导实验组均未发现接种部位有结节或肿瘤,接种部位组织HE染色,可见皮肤、皮下、肌肉结构层次清晰,未见明显异常。阴性对照组未发现接种部位有结节或肿瘤,接种部位组织HE染色,可见皮肤、皮下、肌肉结构层次清晰,未见明显异常。阳性对照组接种后第2天可见小白点,随着时间的推移呈进行性增大,2周时可见接种部位瘤体组织直径约1cm,瘤体组织HE染色可见明显癌巢。4个诱导组的细胞按染色体G显带核型制片,参照人类细胞遗传学国际命名体制,用染色体图像分析仪进行核型分析,核型正常,无染色体的倒位、易位、缺失、复制或融合等畸变。结论:本研究采用的不同浓度的地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C组成的诱导体系体外诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,经诱导的人骨髓间充质干细胞及其分化的成骨细胞未发现致瘤性,其染色体G显带核型正常,符合作为骨组织工程种子细胞应用的关于生物安全性的有关要求。
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【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R329

【引证文献】