【摘要】：研究背景及目的 异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是目前治愈造血系统恶性肿瘤的有效手段,但移植物抗宿主病(GVHD)等并发症的发生限制了HSCT的广泛应用。GVHD的本质是由供者移植物中的T淋巴细胞识别宿主表面抗原引起的免疫反应所导致的受者多器官损伤。传统的防治策略如免疫抑制剂及T细胞去除术无法完全解决GVHD,反而削弱机体抗感染免疫及影响移植物抗白血病效应(GVL)。重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)动员的外周血干细胞已逐渐成为造血干细胞的一种主要来源,现广泛用于治疗恶性和非恶性血液疾病的allo-HSCT中,与骨髓移植相比,虽然输入10倍以上的成熟T淋巴细胞,但GVHD的发病率和严重程度并未明显增加。有研究表明G-CSF动员的外周血干细胞移植GVHD低的机理可能是G-CSF对T细胞的免疫调节效应,包括：①促使T细胞免疫低反应性,并且由Thl向Th2极化；②增加免疫调控作用,包括增加移植物中树突状细胞(DC)的数量、促进CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)分化、诱导耐受性DC细胞分化等,但上述机制并不能完全解释G-CSF诱导免疫耐受的全部机制。 人类白细胞抗原G (HLA-G)作为一种具有免疫抑制功能的分子正日益受到关注。HLA-G1～G4亚型为膜结合型,HLA-G5～G7亚型为可溶型。HLA-G作为免疫抑制分子参与移植后免疫耐受,已证实其在实体器官移植领域发挥了重要作用,如HLA-G在肾、心脏移植患者中表达能减少患者移植排斥的发生,但HLA-G在HSCT中所起作用尚不明确,最近有报道allo-HSCT后受者体内可溶性HIA-G对急性GVHD的发生起负性调节作用,在allo-HSCT后HLA-G的表达随着时间递增的患者的急性GVHD发生率低。孕激素、糖皮质激素等因素可上调HLA-G的表达,近年发现一些细胞因子如IFN-γ、IL-10也可上调HLA-G的表达。我们前期研究发现：经G-CSF动员后供者体内骨髓单个核细胞的HLA-G表达明显增高；体外实验也证实G-CSF能上调培养的骨髓单个核细胞表面HLA-G表达,尤其是CD3+T细胞表面HLA-G表达,并且异源性T细胞增殖反应受抑制；G-CSF与骨髓细胞共培养后上清中IL-10及IFN-γ水平增高。但G-CSF上调HLA-G表达的途径是通过G-CSF直接作用、还是通过IL-10及IFN-γ介导的间接作用尚未阐明。HLA-G与移植物耐受相关,可溶性HLA-G5能抑制T细胞的增殖,介导T细胞表型改变为CD4low或CD8low；膜型HLA-G1能抑制外周血中NK细胞的细胞毒作用、细胞毒T细胞的抗原特异性细胞毒作用、T细胞及NK细胞的增殖以及树突状细胞的成熟和功能等,膜型HLA-G2、G3、G4也能抑制NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞的细胞溶解作用,然而目前关于可溶性HLA-G6、HLA-G7功能的研究极少。 为深入揭示G-CSF介导的HLA-G诱导免疫耐受机理以及G-CSF动员后抑制GVHD发生的机制,本研究第一部分首先探讨G-CSF上调HLA-G表达的调控机制,这也是前期研究的延续和深入。本研究第二部分着重分析allo-HSCT患者移植前后HLA-G各亚型表达的变化情况,探讨其变化与GVHD发病的相关性。 方法 采集健康志愿者骨髓(正常骨髓)15ml。常规提取骨髓单个核细胞,调整正常骨髓细胞浓度为5×105个细胞/ml,分别转入6孔培养板,分组为：①正常骨髓细胞2 ml；②正常骨髓细胞2ml、G-CSF;③正常骨髓细胞2ml、G-CSF、IL-10阻断抗体；④正常骨髓细胞2ml、G-CSF、IFN-γ阻断抗体；⑤正常骨髓细胞2ml、G-CSF、IL-10阻断抗体、IFN-γ阻断抗体。每组各2个复孔,G-CSF浓度均为15μg/ml、阻断抗体浓度为10μg/ml,培养24h。采用HLA-G-FITC(SantaCruz,美国)、CD3-PE-CY5、CD4-PE、CD8-PE (BioLegend,美国)单抗,用三标法测定骨髓单个核细胞中CD3+CD4+、CD3+CD8+ T淋巴细胞膜表面HLA-G表达。采用CD14-PE (BioLegend,美国)标记骨髓单核细胞、CD19-PE (BioLegend,美国)标记骨髓B淋巴细胞、CD56-PE标记NK细胞。以鼠抗人IgG-FITC、鼠抗人IgG-PE单抗、鼠抗人IgG-APC单抗作为同型对照(BioLegend,美国)。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组中培养上清的可溶性HLA-G表达水平。 采集58例造血干细胞移植患者移植前、移植后+15d、移植后+30d外周血4ml,同时采10例健康人外周血做对照,提取外周血单个核细胞,并留血清。细胞膜表面HLA-G表达测定采用流式细胞术,血浆sHLA-G5、G6、G7检测采用ELISA法(HLA-G5、HLA-G6、HLA-G7试剂盒,RD,美国)。 采用SPSS13.0统计软件包进行数据处理。结果用均数±标准差(X±SD)表示,两组间比较采用独立样本t检验,进行统计分析,三组或以上比较采用方差分析。P0.05为差异有统计学意义。 结果 1、G-CSF诱导免疫耐受机理 体外培养实验中,G-CSF单独刺激组、G-CSF+IL-10抗体组、G-CSF+IFN-γ抗体组及G-CSF+IL-10抗体+IFN-γ抗体组的CD3+CD4+ T淋巴细胞、CD3+CD8+T淋巴细胞的膜HLA-G表达明显高于空白未刺激组(P值均0.05)。G-CSF单独刺激组、G-CSF+IL-10抗体组、G-CSF+IFN-γ抗体组及G-CSF+IL-10抗体+IFN-γ抗体组的培养上清中可溶性HLA-G表达水平亦显著高于空白组(P值均0.05)。阻断IL-10组、阻断IFN-γ组及同时阻断IL-10和IFN-γ组的CD3+CD4+T淋巴细胞、CD3+CD8+T淋巴细胞的膜HLA-G表达与G-CSF单独刺激组相比均无显著差异(P值均0.05)。阻断IL-10组、阻断IFN-γ组及同时阻断IL-10和IFN-γ组的培养上清中可溶性HLA-G的表达与G-CSF单独刺激组比较,无显著差异(P值均0.05)。在加入G-CSF刺激前,CD19+B淋巴细胞、CD14+单核细胞、CD56+NK细胞中膜HLA-G的表达量很低,经G-CSF刺激后,膜HLA-G的表达在各细胞亚群中有不同程度增高；阻断IL-10、阻断IFN-γ及同时阻断IL-10及IFN-γ对B淋巴细胞、单核细胞、NK细胞的膜HLA-G表达无明显影响。 2、HLA-G与GVHD的相关性 患者移植前HLA-G5、HLA-G6、HLA-G7均值接近正常人均值的2倍,以HLA-G5量最多,其次为HLA-G6,最少为HLA-G7。移植后未发生急性GVHD组,移植后+15天及+30天时HLA-G5值较预处理前HLA-G5值明显增大。随GVHD严重程度的增加,移植后HLA-G5的分泌水平降低。与移植前水平相比,未发生慢性GVHD组在移植后+30天时HLA-G5及HLA-G6表达水平的增加值显著大于发生慢性GVHD组(均有P0.05),但移植后+15天HLA-G5及HLA-G6表达水平较移植前的增加值在是否发生慢性GVHD组间无显著性差异(P值均0.05)。移植后未发生急性GVHD组,移植后+15天及+30天时HLA-G6表达水平较预处理前水平增高,但差异无统计学意义。移植后+15天及+30天时的HLA-G7水平与移植前水平的差异与急慢性GVHD发生均不相关。自体造血干细胞移植患者移植前后外周血可溶性HLA-G分泌水平在移植前后变化不大。供者来源、HLA-配型,免疫抑制剂对HLA-G的表达水平影响不大。移植后+15天及+30天可溶性HLA-G表达水平较移植前水平增高对复发率无显著影响。 讨论 G-CSF动员的外周血干细胞移植发生GVHD低的机理可能是G-CSF对T细胞的免疫调节效应,可能的机理包括：①促使T细胞免疫低反应性,并且由Th1向Th2极化：②增加免疫调控细胞的数量和功能。而G-CSF在动员的allo-HSCT中诱导免疫耐受的机理目前尚未完全阐明。HLA-G作为一种具有免疫抑制功能的分子在参与移植后免疫耐受中发挥了重要作用,尤其在实体器官移植领域。HLA-G具有较严格的组织分布：最早发现于母胎界面的绒毛膜滋养层细胞上,参与保护胚胎免受母体淋巴系统的攻击,仅限制性的在滋养层细胞、胸腺、角膜中表达。随着检测水平的发展,在人类胚胎的很多组织包括胎肝、眼、心脏和肺的细胞表面都检测到HLA-G的表达。HLA-G可在头3个月的胎盘绒毛、血管内皮细胞、未成熟红细胞、胸腺表皮细胞和神经胶质细胞以及活化的外周血单核细胞上表达。HLA-G抗原除了以膜抗原的形式存在于细胞膜表面外,目前已从人类血清和淋巴液、尿液及乳汁等体液中相继发现少数几种可溶性的HLA-G的蛋白异构体。最近有研究报道,HLA-G可在部分CD4+和CD8+T细胞中表达,CD4+、CD8+ T淋巴细胞及NK细胞可以从HLA-G阳性的APCs及肿瘤细胞表面获取HLA-G。近年发现一些细胞因子如IFN-γ、IL-10也可上调HLA-G的表达。我们前期研究发现：在体内经G-CSF动员后的骨髓单个核细胞中HLA-G的表达增高；体外实验也证实G-CSF能上调培养的骨髓单个核细胞表面HLA-G表达,尤其是CD3+T细胞表面HLA-G表达,并且异源性T细胞增殖反应受抑制；G-CSF与骨髓细胞共培养后上清中IL-10及IFN-γ水平增高。但G-CSF上调T细胞表面HLA-G表达是G-CSF直接作用、还是通过IL-10及IFN-γ介导的间接作用并没有深入探讨。为明确G-CSF上调HLA-G表达的机制,本研究在体外培养中采用IL-10和IFN-γ单抗阻断IL-10、IFN-γ,观察G-CSF对骨髓细胞表达HLA-G的影响,结果发现G-CSF刺激CD3+CD4+T淋巴细胞及CD3+CD8+T淋巴细胞表面HLA-G的表达并不依赖IL-10、IFN-γ细胞因子,G-CSF可能直接作用于T淋巴细胞诱导HLA-G的表达。 在实体器官移植中,HLA-G能减少急慢性移植排斥反应；在造血干细胞移植中,HLA-G能诱导CD4+CD25+调节性T细胞产生,减少急性GVHD的发生,其表达与急性GVHD负相关。我们对58例患者在移植预处理前和移植后+15天及+30天进行外周血HLA-G的检测,结果发现,HLA-G5在移植后的表达水平增高,则急/慢性GVHD发生率低,且随着GVHD严重程度的增加,HLA-G5表达水平递减。并且我们同样检测了移植前后HLA-G6和HLA-G7的表达水平,虽然从数值上看发生急性GVHD的患者HLA-G6及HLA-G7移植后相对移植前的表达增加水平均较未发生急性GVHD组低,但是差异无统计学意义。移植后+30天HLA-G6分泌水平高,则慢性GVHD发生率低；HLA-G7分泌水平未发现与急慢性GVHD发生率相关。推测HLA-G5表达相对增加水平与急慢性GVHD的发生关系更为密切,HLA-G6可能与慢性GVHD相关,HLA-G5的移植后相对增加水平可能能够预测急慢性GVHD的发生。这给我们临床寻找早期预测GVHD以及评价GVHD严重程度的观察指标提供了一个新的思路。另外,自体造血干细胞移植患者移植前后可溶性HLA-G变化不大,提示预处理对可溶性HLA-G的表达影响不大。供受关系、HLA配型、免疫抑制剂对可溶性HLA-G的表达无明显影响,可溶性HLA-G表达水平升高与复发无关。 结论 G-CSF可能通过直接作用于T淋巴细胞来上调HLA-G的表达,而不依赖IL-10、IFN-γ细胞因子。供受关系、HLA配型、免疫抑制剂对可溶性HLA-G的表达无明显影响,且可溶性HLA-G表达水平升高与复发无关。HLA-G5表达水平与急、慢性GVHD的发生密切相关,HLA-G5的移植后较移植前的增高水平可能预测急慢性GVHD的发生。HLA-G6 HLA-G6可能与慢性GVHD相关,与急性GVHD不相关,HLA-G7的变化与GVHD无显著相关性。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392
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