rhBMP9的真核表达，纯化及体外生物骨诱导活性分析

发布时间：2019-04-23 11:21

【摘要】：骨形态发生发生蛋白（Bone morphogenetic proteins, BMPs)自被发现以来，因其多样的生物学作用受到广泛重视。BMPs在胚胎的发生、发育、组织和细胞的分化、增殖等方面都起着非常重要作用，而最受关注的是其对多能干细胞的骨诱导作用。BMPs是转化生长因子(Transformation growth factor, TGF-β)超家族的成员，目前鉴定分离出20多个成员，其中具有较强骨诱导活性的成员主要包括BMP-2、4、6、7、9。BMP-9（又名GDF-2，growth differentiation factor2）是BMPs中重要的家族成员，有研究显示BMP-9诱导成骨作用远强于已允许用于临床的BMP-2和BMP-7，因而有希望成为更强的骨诱导因子应用于临床。骨再生和骨形成是在一个复杂的生物网络下，多种因子共同参与完成的，目前对BMP-9在骨形成和骨再生过程中的作用以及诱导成骨的机制了解不足，，但基于BMP-9强大的骨诱导能力，迫切希望其能尽快在临床中发挥作用。采用重组腺病毒作为载体介导的方法，证实了BMP-9体外的成骨诱导作用和体内的异位骨化。尽管重组腺病毒是一种缺陷病毒，理论上不会对宿主细胞造成遗传性质的改变，是一种理想的实验性表达系统，然而通过其介导应用于临床还需要一个长期的过程。BMPs免疫原性低，只具有轻微的免疫刺激能力，通常不会引起免疫排斥反应，因此提取纯化BMP-9蛋白直接应用到临床不失为一种简便快捷的办法。哺乳动物细胞表达系统是一种优秀的真核表达系统，超过50%的复杂药物蛋白都是通过该系统生产的。缺陷型中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary dihydrofolate reductase-deficient CHO-dhfr-）是目前复杂药物蛋白严制和生产的首选表达体系，它是外源真核基因表达的最好宿主细胞，外源蛋白容易在CHO细胞中表达合成，而且易于分泌到培养液中去，表达蛋白的二硫键的形成以及蛋白各种形式的折叠与自然合成的蛋白质基本一致，BMP-9在翻译后会经过糖基化修饰，以二聚体的形式分泌到胞外。本研究的目的是：（1）通过PCR技术构建真核表达质粒pcDNA4/His Max-BMP-9；（2）利用CHO-dhfr-建立稳定的真核表达系统，纯化出rhBMP-9，并对其进行鉴定；（3）通过刺激培养间充质干细胞，检测rhBMP-9骨诱导活性。本研究的第一部分以质粒padtrack-cmv-bmp9为模板，进行PCR扩增得到hBMP-9cDNA，再将cDNA插入到质粒pcDNA4/His Max A中，再通过PCR，酶切及测序鉴定，最终得到真核表达载体pcDNA4/HisMax-hBMP-9。结果显示，插入的hBMP-9cDNA没有发生碱基突变，读码框完全正确，可以进行下一步实验。本研究的第二部分是利用脂质体将新质粒与质粒pSV2-dhfr按比例6：1共转染CHO-dhfr-细胞，用含有100μg/ml博来霉素的IMDM进行筛选，不同浓度梯度的MTX逐级加压培养，得到稳定表达rhBMP-9的抗性单克隆株。收集最高表达蛋白的单克隆株培养基上清，经His标签的蛋白纯化柱纯化，再经过Western Blot鉴定得到rhBMP-9。ELISA检测最高表达rhBMP-9的单克隆株的表达量为1.13μg/24h/106cells；Western Blotting和SDS-PAGE鉴定显示有两条明显的分子量分别约32kD和50kD的条带。从结果看，rhBMP-9的表达量并不是很高，rhBMP-9是以二聚体的形式分泌到细胞外，给蛋白纯化带来一定的困难。第三部分研究是通过得到的rhBMP-9体外刺激培养小鼠间充质干细胞C3H10，检测C3H10的成骨效应。用含100μg/ml的rhBMP-9培养基培养C3H10，分别于7天检测碱性磷酸酶活性及其染色，20天检测钙盐沉积、骨钙素和骨桥蛋白的表达。另外，用rhBMP-9刺激培养三天C3H10联合医用明胶海绵（100μg/ml的rhBMP-9溶解）注射BALB/c裸鼠。以相同浓度的rhBMP-2作为实验对照。结果显示：各项成骨指标rhBMP-9都不及rhBMP-2；体外实验两种蛋白都未形成骨块。综上所述，我们能够利用生物基因工程技术构建稳定的真核表达系统，而且利用特定的蛋白标签可以将rhBMP-9纯化出来且表现出一定的生物学活性。然而蛋白的表达量和骨诱导活性并没有达到预期，主要原因可能是筛选的单克隆株并不十分稳定，在多次传代后降低了蛋白的表达；另外，rhBMP-9在CHO-dhfr-表达后形成了二聚体，在分泌过程中会以多种形式存在，纯化过程中导致部分有活性的rhBMP-9丢失。尽管实验结果稍显遗憾，但该研究对rhBMP-9尽快应用临床提供了新的途径，因此，能否通过外源性基因的干扰，获得更加稳定高表达系统，利用新的方法纯化出有活性蛋白值得我们进一步思考和研究。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

【参考文献】