从上皮间充质转化探讨Tbx18阳性心外膜祖细胞向心系细胞分化的机制的研究

发布时间：2019-04-28 19:21

【摘要】：2008年蔡晨冷等人利用Cre-LoxP遗传示踪发系统现,小鼠心外膜组织中存在一种新的心脏祖细胞-Tbx18阳性心外膜祖细胞,这种心脏祖细胞不断迁移分化为心系细胞并对心脏室间隔、心房、心室肌、心瓣膜及冠状动脉的形成具有重要贡献。因而,Tbx18阳性心外膜祖细胞有可能成为心脏祖细胞新的来源。学者们发现,在成年斑马鱼及小鼠心脏损伤处存在心外膜胚胎基因Tbx18的重新激活并通过血管生成作用参与了心脏的损伤修复反应,提示Tbx18阳性心外膜祖细胞可能是心脏损伤修复的潜在的种子细胞。由此可见,深入、全面的研究胚胎时期Tbx18阳性心外膜祖细胞迁移分化为心系细胞的机制对理解成年心脏损伤修复机制有重要启发意义。上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指在机体正常发育过程中以及目前已知的各种生理、病理条件刺激作用下,上皮细胞的结构与功能均会发生向间叶细胞转分化的现象：即细胞从具有紧密连接、极性和缺乏动力的上皮细胞表型转化为细胞间作用松散、无极性、活动力强和能产生细胞外基质的间质细胞。这个过程与胚胎发育、器官形成、疾病和肿瘤侵袭密切相关。已有研究表明,鸡及小鼠胚胎心脏发育过程中,心外膜祖细胞经历EMT事件并能分化为血管内皮细胞,冠状动脉血管平滑肌细胞及心脏成纤维细胞。存在于小鼠心外膜上皮中的Tbx118阳性心外膜祖细胞也有可能是通过EMT事件向心系细胞分化。本研究首先建立和鉴定Tbx18基因敲除小鼠模型和遗传示踪小鼠模型。为验证上皮间充质转化是Tbx18阳性心外膜祖细胞向心系细胞分化的机制。我们利用Tbx18:Cre/R26RlacZ和Tbx18:Cre/R26REYFP这两种Tbx18基因遗传示踪小鼠模型验证EMT事件参与了Tax18阳性心外膜祖细胞向心系细胞分化。同时利用Tbx18基因敲除小鼠模型验证Tbx18基因敲除小鼠心脏表型和受损上皮间充质转化的关系。最后利用Tbx18基因敲除小鼠模型和遗传示踪小鼠模型深入探讨EMT主要标志物Snail1, Smad, Slug, Twist和E-cadherin作为局部信号在Tbx18阳性心外膜祖细胞向心系细胞分化中的作用。第一部分Tbx18基因敲除小鼠模型和遗传示踪小鼠模型的建立及鉴定目的：探讨建立及鉴定Tbx18基因敲除小鼠模型和遗传示踪小鼠模型的方法,为后续研究Tbx18阳性心外膜祖细胞向心系细胞分化的机制奠定基础。方法：将引进的Tbx18-Cre基因敲入杂合子小鼠进行繁殖,并用PCR法鉴定其子代基因型。将子代雌雄杂合子小鼠互交,得到的Tbx18基因敲除、杂合子和野生型胚鼠,并用PCR.荧光定量PCR及胚胎大体形态鉴定出胚鼠基因型。将杂合子小鼠与RosaEYFP和Rosa26RLcz报告小鼠交配,得到Tbx18:Cre/Rosa26REYFP和Tbx18:Cre/Rosa26RLacz双转基因胚鼠,心脏行冰冻切片进行免疫荧光检测。结果：成功繁殖并鉴定了一定数量的Tbx18-Cre基因敲入杂合子小鼠。利用Tbx18-Cre基因敲入杂合子小鼠和报告小鼠成功建立了Tbx18基因敲除小鼠模型和遗传示踪小鼠模型。PCR、荧光定量PCR及胚胎大体形态观察结论一致性的检测出基因敲除胚胎。PCR及免疫荧光检测成功鉴定出Tbx18:Cre/Rosa26REYFP和Tbx18:Cre/Rosa26RLacz双转基因胚鼠。结论：成功建立了Tbx18基因敲除小鼠模型和遗传示踪小鼠模型。用于繁殖、基因敲除及基因遗传示踪的子代基因型鉴定结果均符合孟德尔遗传规律。PCR技术鉴定小鼠子代基因型具有廉价、简单、准确的特点。第二部分上皮间充质转化是Tbx18阳性心外膜祖细胞向心系细胞分化的重要机制目的：探讨Tbx18阳性心外膜祖细胞向心系细胞分化的可能机制。方法：1)观察Tbx18:Cre/Rosa26REYFP和Tbx18:Cre/Rosa26RLacz不同发育阶段胚鼠Tbx18阳性心外膜祖细胞迁移分化过程。2)通过Tbx18基因敲除模型观察Tbx18基因敲除小鼠心脏表型和受损上皮间充质转化的关系结果:1)在E11.5天,Tbx18阳性心外膜祖细胞覆盖在心脏表面,E13.5天及E16.5天可见Tbx18阳性心外膜上皮细胞向心外膜下迁移形成间充质细胞,即经历了上皮间充质转化。这些间充质细胞构成了左右心室壁、心房,室间隔,冠状动脉血管平滑肌。2)E16.5天基因敲除心脏和野生型相比,四个腔室、瓣膜及右室壁未见异常,左室游离壁及室间隔室壁发育中等变薄,窦房结头部缺失。与之相对应的是,E16.5天基因敲除心脏心系细胞标志物(除cTnT外)及间充质细胞标志物vimentin显著减少。Vimentin显著减少的部位在室间隔。绪论:bx18阳性心外膜祖细胞经历上皮间充质转化后向心系细胞分化,Tbxl8基因敲除小鼠心脏表型和受损上皮间充质转化存在密切关系。因此上皮间充质转化是Tbxl8阳性心外膜祖细胞向心系细胞分化的重要机制。第三部分上皮间充质转化主要标志物在Tbx18阳性心外膜祖细胞向心系细胞分化过程中的作用目的：上皮间充质转化主要标志物Snail1, Smad, Slug, Twist和E-cadherin在Tbxl8阳性心外膜祖细胞向心系细胞分化中的作用。方法：利用免疫荧光、Western blot及荧光定量PCR技术比较Tbxl8基因敲除小鼠和野生小鼠上皮间充质转化主要标志物Snail1, Smad, Slug, Twist和E-cadherin的表达差异；利用激光共聚焦技术和流式细胞分选术观察Tbxl8:Cre/Rosa26REYFP不同时期胚胎心脏Tbxl8谱系细胞(包括心外膜祖细胞及其后代细胞)内这些上皮间充质转化主要标志物的时空表达规律。结果：1)和野生型小鼠相比,Tbxl8基因敲除小鼠心脏Snail1, Smad,Slug, Twist在mRNA和蛋白水平表达均显著下调,E-cadherin显著上调。2)E16.5天心脏Tbx18谱系细胞和上述上皮间充质转化主要标志物在室间隔,心瓣膜,冠状动脉血管平滑肌部位发生共聚焦。这些标志物和Tbx18基因在E12.5天至出生后第一天心脏内表达水平呈现抛物线表达模式。结论：上皮间充质转化主要标志物Snail1, Smad, Slug, Twist、 E-cadherin作为局部信号促进了Tbx18阳性心外膜祖细胞向心系细胞分化。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329.2

【参考文献】