Srd1与Rim9蛋白在白念珠菌pH应激反应通路中的作用研究

发布时间：2019-04-29 07:56

【摘要】：白念珠菌（Candidaalbicans）是人类的条件致病性真菌，近年来，由于其感染率逐年上升而越来越受到人们的重视。白念珠菌致病的重要条件之一是其应对外界环境变化的适应能力。其中，最关键的是应对生存环境pH变化的能力。在不同pH下白念珠菌的形态和毒力都各有不同，在酸性环境中以酵母态细胞生长，而在碱性环境中可由酵母态转变为具有较强致病力的菌丝态。据文献报道，Rim101p应答途径是白念珠菌参与pH调节的一条重要途径，Rim9p是其中一员，发挥辅助感受碱性刺激的作用。通过多蛋白序列比对，我们找到其同源基因SRD1/ORF19.1510，二者都属于Sur7家族，具有相同的Sur7结构域，因此，Srd1p是否也具有Rim9p类似的功能值得进一步研究。目的本文通过敲除SRD1基因并考察其功能，从而推测Srd1p是否与Rim9p蛋白功能相似，是否也参与Rim101p应答通路组成。利用生物芯片技术以期从基因组和转录组水平阐明变异菌株对各类应激敏感性变化的机制。此外，考察His1-Leu2-Arg4基因敲除策略敲除白念珠菌基因时，异源性筛选标记C.maltosaLEU2，C.dubliniensisHIS1和C.dubliniensisARG4对菌株耐受各种刺激的表型影响。方法用MAFFT网站进行多蛋白序列比对。采用His1-Leu2-Arg4基因敲除策略构建SRD1、RIM9单基因缺失菌。结合诺尔丝菌素抗性标记及His1-Leu2-Arg4基因敲除策略构建SRD1、RIM9双基因缺失菌，用麦芽糖培养基反筛去掉诺尔丝菌素抗性标记。套式PCR法鉴定各菌的成功构建。Spotassay实验考察各缺失菌对各刺激敏感性，包括pH刺激、氧化刺激、各种临床抗菌药刺激、金属离子刺激、细胞壁损伤相关药物刺激、渗透刺激和DNA损伤刺激。通过在10%胎牛血清，Spider及Lee’s培养基中考察各缺失菌菌丝形成能力。利用微量液基稀释法及抑菌曲线检测变异菌CaLY188对唑类药物的敏感性。通过FM4-64染色后于激光共聚焦显微镜下观察各缺失菌囊泡的形态。白念珠菌具有高适应性的特点，而基因组的可塑性是其适应压力的一个重要策略。本研究采用生物芯片技术，综合利用比较基因组学（CGH）及表达谱学研究手段，从基因组和转录组水平探讨变异菌CaLY188对唑类敏感性降低及变异菌CaLY55对多种刺激敏感性升高的机制。采用实时定量PCR进行比较基因组芯片和表达谱芯片结果的验证。为考察异源性筛选标记C.maltosaLEU2，C.dubliniensis HIS1和C.dubliniensisARG4对菌株耐受各种刺激的影响，以SN152为亲本菌，采用His1-Leu2-Arg4基因敲除策略分别构建上述三个标记的回复菌，套式PCR法鉴定回复菌的成功构建，Spotassay实验考察菌株对各种刺激的敏感性。结果经套式PCR及琼脂糖凝胶电泳鉴定，各菌株构建成功。Spotassay实验结果显示C.a.SRD1基因敲除菌的所有应激相关表型与亲本菌无差异，SRD1、RIM9双缺失菌的表型基本与RIM9单缺失菌一致，包括碱性pH刺激、氯化锂敏感性升高和菌丝形成缺陷。此外RIM9缺失菌还有一些文献未报道过的表型，如对氟康唑、酮康唑、过氧化氢、羟基脲、荧光增白剂、刚果红等敏感性降低及对两性霉素B和氯化钠敏感性略微升高等。Rim9p和Srd1p蛋白都不影响液泡的形态结构。在构建SRD1基因的敲除菌时我们得到两株变异菌，分别命名为CaLY55和CaLY188。CaLY55对考察的大部分刺激很敏感，比较基因组学表明，菌株中并未发生片段性染色体变异，发生拷贝数变异的基因也极为有限。表达谱学研究表明，，菌株中有400个基因发生差异性表达，按GO分析主要涉及致病过程；应答外界刺激过程；氧化还原过程；羧酸、酮酸及氨基酸代谢过程等。 Spotassay实验、微量液基稀释法和时间杀菌曲线法的结果都显示CaLY188对唑类药物的敏感性降低。比较基因组学表明，菌株中R染色体发生拷贝数变异，比亲本菌多了0.5倍，即由二倍体扩增为三倍体。其SRD1基因回复菌CaLY350也有一致的耐药表型，并且比较基因组学结果R染色体拷贝数同样扩增，与实时定量PCR验证结果相符，提示R染色体拷贝数扩增与耐药表型有一定相关性。CaLY188的表达谱学研究表明，菌株中250个基因发生差异性表达，按染色体分布，76个位于R染色体，占总数的30%，可能是由于基因组水平拷贝数增加引起的。 PCR验证七种异源筛选标记回复菌株构建成功，Spotassay结果显示各回复菌对pH刺激、氧化刺激、各种临床抗菌药刺激、金属离子刺激、渗透刺激、DNA损伤剂刺激的敏感性与亲本菌SN152一致。而给予0.02%SDS刺激时各菌株的敏感性不一致，缺乏C.d.HIS1标记的菌株在0.02%SDS刺激下不能生长。结论 C.a.SRD1基因的敲除菌并没有任何应激相关表型。在SRD1和RIM9双缺失菌中也不能增强RIM9缺失的效应，发挥应激和菌丝形成相关功能的是Rim9p，而不是Srd1p。Rim9p对菌丝形成能力方面的影响，不仅仅依赖于外界环境的碱性pH，在中性pH时也同样发挥作用。 CaLY55对众多应激条件敏感，但并不是由基因组拷贝数变化引起的。从转录组水平来看近50%差异性表达的基因可能涉及应激应答，使其在无外加刺激的营养丰富YPD培养基中便已处于“天然”应激状态，因此表现出对绝大多数外加刺激敏感性升高。5个菌丝形成抑制因子的高表达使其表现出菌丝形成能力明显降低的现象。 CaLY188的耐药表型主要是由基因组DNA水平发生染色体拷贝数变异引起的，通过使R染色体的扩增提高麦角甾醇合成通路ERG25基因的表达导致对唑类药物耐受。且这种耐药表型是不依赖CDR1、CDR2和MDR1的。 C.d.HIS1、C.m.LEU2和C.d.ARG4三个异源性筛选标记不影响白念珠菌对大部分刺激的敏感性，不同标记基因敲除菌间可以相互比较，且可以统一用SN152作为对照菌株。在考察SDS刺激时，所用筛选标记不同，对结果有影响，不能用SN152代替作为统一对照，若要相互比较，要保证C.d.HIS1标记必须一致。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R379

【参考文献】