【摘要】：调节性T细胞(Regulatory T cells, Treg)是一类通过抑制T细胞增殖和细胞因子分泌进而抑制机体免疫反应、防止持续炎症反应攻击健康组织的T细胞在免疫病理、移植物耐受、保持自身抗原的耐受性以阻止自身免疫反应和维持机体免疫平衡方面,Treg均发挥着重要的作用。Treg细胞功能缺陷可导致人类多种自身免疫性疾病,如类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、重症肌无力等。Treg细胞包括CD4+Treg. CD8+Treg、NKTTreg和双阴性Treg细胞四大类。其中,CD4+CD25+Treg细胞是目前研究最为广泛的Treg细胞。CD4+CD25+Treg细胞除表达CD25分子外,还表达一系列免疫调节相关的标志物,如细胞表面的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(Glucocorticoid induced tumor necrosis factor receptor, GITR)家族相关基因和细胞核内的叉头／翼状螺旋转录因子P3(Forkhad box P3, Foxp3)。Foxp3是Treg细胞维持自身免疫平衡所必需的分子。体内和体外实验都已证明,转化生长因子β1(Transforming growth factor β, TGF-β1)可诱导CD4+T细胞表达Foxp3,形成具有免疫抑制功能的Treg细胞。 丫δ T细胞因其表面表达由γ链和δ链组成的T细胞受体(T cell receptor, TCR)而得名,在抗原识别和免疫应答中具有特殊的作用。γδT细胞主要分布于皮肤、小肠、肺和生殖器官等粘膜及皮下组织,而在人类外周血中,TCR γδ约表达于0.5%-10%的CD3+T细胞表面。γδ T细胞又根据δ链的不同分为V81T细胞和V82T细胞两种类型。Vδ1T细胞多位于小肠上皮组织中,是小肠上皮内淋巴细胞(Intestine intraepithelial lymphocytes, iIELs)的重要组成部分,而其在外周血中的数量仅为γδT细胞总量的20%；V82T细胞主要见于外周血,约占γδT细胞总量的70%。Vδ2T细胞具有显著的细胞毒性作用和对微生物重复感染的记忆反应功能。由于人类外周血中V81T细胞含量较少,并且体外扩增存在一定难度,因此对外周血中Vδ1T细胞的生物学特性和功能知之甚少。iIELs主要位于小肠绒毛柱状上皮内,为一类组织松散的浸润性淋巴细胞。iIELs由于数量众多并在粘膜免疫防御中具有重要作用,因而成为IELs研究的热点之一。iIELs的表型和功能呈现多样性,依据表面TCR组成的不同分为αβ T细胞和γδ T细胞。前者具有显著的细胞毒活性,因而参与小肠粘膜的免疫应答反应；后者的功能尚未完全明确,但已有的研究显示该细胞功能具有多样性,包括免疫防御、细胞毒活性等。而最近更多的研究显示,γδT细胞具有免疫调节潜能。因此,本文将针对这一科学问题展开相关研究。 本研究旨在验证人外周血单个核细胞(Peripheral blood monouclear cells, PBMCs)来源的Vδ1T细胞以及小鼠iIELs来源的γδ T细胞是否具有免疫调节功能。根据以上研究内容,本论文分为两部分。第一部分通过在有或无外源性转化生长因子β1(TGF-β1)的情况下,检测抗TCR Vδ1单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)扩增的、人PBMCs来源的V81T细胞内Foxp3的表达情况。结果显示,即使无外源性TGF-β1,抗TCR Vδ1mAb亦可扩增获得大量Foxp3+V81T细胞,且Foxp3分子在V81T细胞中稳定表达。应用酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测抗TCR Vδ1mAb扩增的PBMCs上清中是否存在TGF-β1。结果显示,培养上清中存在较高水平的TGF-β1。应用流式细胞技术(Fluorescence-activated cell sorting, FACS)检测发现V81T细胞是TGF-β1的主要来源细胞,且V81T细胞表达较高水平的TGF-β1受体(CD105)。接下来我们检测了Foxp3+Vδ1T细胞所表达的其它Treg细胞相关的表面标志物和细胞因子。结果显示,V81T细胞可表达GITR、CTLA-4、CD25等Treg细胞常见的表面分子和白介素-10(interleukin-10, IL-10)、TGF-β1。最后我们应用CFSE方法检测发现, CD25high V51T细胞对CD4+T细胞的增殖具有显著的抑制作用。以上研究结果提示,Foxp3+Vδ1T细胞是一种Treg细胞。这为某些肠上皮的炎症性疾病的发病和治疗、移植免疫免疫耐受机制的研究奠定了基础。 本论文的第二部分通过分离获得C57BL/6J小鼠的iIELs,经TGF-β1和γδTCR抗体(antibody, Ab)共同作用后,应用流式细胞技术检测γδ T细胞内Foxp3分子的表达情况。结果显示,TGF-β1和γδ TCR抗体可以共同诱导Foxp3+γδ T细胞的产生。同时,我们应用CFSE染色的方法检测发现,Foxp3+γδ T细胞对CD4+T细胞的增殖具有显著的抑制作用。以上结果表明,TGF-β1和γδ TCR抗体在体外能够共同诱导小鼠的iIELs产生Foxp3+γδ T细胞,并且该细胞具有免疫调节功能。这为阐明TGF-β1在小肠上皮免疫调节性γδ T细胞产生中的作用,以及某些小肠自身免疫性疾病的发病机制和治疗提供了线索。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392
【共引文献】
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本文编号：
2472886
