【摘要】：肺纤维化(pulmonary fibrosis, PF)是由多种原因引起的弥漫性肺部炎性疾病。流行病学调查发现：近年来，肺纤维化的发病率、死亡率不断上升，而且随着年龄的增长，其发病率和死亡率也逐渐升高。研究发现，PF发病机制可能涉及氧化应激导致肺上皮损伤、炎症细胞浸润及随后细胞因子网络平衡被打破，最终导致细胞外基质(extracellular matrix, ECM)重塑和胶原的大量堆积。但目前肺纤维化确切的发病机制尚未完全阐明，没有令人满意的治疗方法。深入探讨肺纤维化发病机理和寻找行之有效的治疗药物仍是目前医学界迫切需要解决的问题。 内质网应激(Endoplasmic reticulum stress, ERS)是近年来人们认识到的除线粒体凋亡通路和死亡受体通路两大经典细胞凋亡途径之外的又一重要细胞凋亡途径。研究发现，由它引起的细胞凋亡在心血管、神经、肝脏等疾病的发生发展中具有重要作用，但肺纤维化是否存在内质网应激，以及内质网应激在肺纤维化中的作用，仅有较少文献报道。因此，本研究通过建立平阳霉素诱导的大鼠肺纤维化模型以及体外采用毒胡萝卜素(Thapsigargin, TG)诱导人胚肺成纤维细胞凋亡的方法，在体与离体观察内质网应激标志性蛋白：葡萄糖调节蛋白(glucose regulatedprotein, GRP)和CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancerbinding proteinhomologous protein, CHOP/GADD153)表达的动态变化，初步探讨ERS在肺纤维化中的作用。主要研究内容概括如下： 1.内质网应激相关蛋白在平阳霉素诱导的大鼠肺纤维化模型中的动态变化 目的：观察内质网应激相关蛋白在平阳霉素诱导的大鼠肺纤维模型中的动态变化。方法：将48只雄性Wistar大鼠随机分成正常组(C组)和模型组(M组)，每组24只。M组气管内一次性滴注盐酸平阳霉素(5mg/Kg)，C组则滴注等量0.9%生理盐水，进行造模。两组动物均于造模后的第7天、第14天和第28天分别随机处死8只，各组取动物肺组织行病理切片，采用苏木精-伊红染色(HE染色)、Masson三联染色和原位末端标记(TUNEL)法观察肺组织病理形态和细胞凋亡情况，并评价成模效果。采用RT-PCR、Western blot检测组织中内质网标志性蛋白：葡萄糖调节蛋白(glucose regulated protein78, GRP78)、CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP/GADD153)的表达变化。结果及结论：HE染色和Masson染色结果表明平阳霉素成功诱导了大鼠的肺纤维化，TUNEL法发现，与正常组比较，模型组细胞凋亡较多，，且随时间延长而增多，28天时尤为明显。RT-PCR、Western blot结果显示：模型组中GRP78、CHOP均有表达，并高于正常组。以上结果提示在平阳霉素诱导的大鼠肺纤维化过程中，内质网应激相关蛋白的表达发生了变化表明内质网应激可能参与了平阳霉素诱导的大鼠肺纤维化过程。 2.毒胡萝卜素对人胚肺成纤维细胞凋亡影响的初步探讨 目的：研究内质网应激(Endoplasmic reticulum stress, ERS)标识物葡萄糖调节蛋白(glucose regulated protein, GRP)和CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP/GADD153)在人胚肺成纤维细胞凋亡过程中的表达变化，初步探讨毒胡萝卜素对人胚肺成纤维细胞凋亡的作用及部分机制。方法：体外用毒胡萝卜素(Thapsigargin, TG)诱导人胚肺成纤维细胞(MRC-5)后，荧光显微镜下观察细胞凋亡形态学变化，采用流式细胞仪检测细胞的凋亡变化，RT-PCR检测细胞中GRP78,CHOP mRNA的表达变化，Western blot检测GRP, CHOP及Caspase-3蛋白的表达情况。结果及结论：MRC-5细胞经毒胡萝卜素TG(4μmol/L)作用24小时后，荧光显微镜观察到细胞呈典型的凋亡形态变化，早期凋亡细胞核染色质呈固缩状、圆珠状或斑块状；晚期凋亡细胞核染色质呈固缩状或斑块状。细胞经1、2、4、8、10μmol· L~(-1)TG作用24h后，凋亡率分别为4.39%,6.66%,13.08%,22.58%,55.34%高于正常组，TG组中GRP, CHOP表达均高于对照组；同时不同刺激组中Caspase-3的表达高于对照组，提示毒胡萝卜素可诱导了人胚肺成纤维细胞发生凋亡，该凋亡可能与内质网应激有关。
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【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363
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本文编号：2476567
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