【摘要】：研究背景 近年来,以干细胞为代表的再生医学为多种终末期疾病的临床再生治疗带来了新的希望。在心血管病、神经损伤修复、肝脏衰竭等多种危害人类健康的重大疾病的治疗领域具有非常广阔的应用前景。其中自体骨髓来源间充质干细胞(BMSCs)由于取材方便、体外扩增能力强、无免疫原性、不涉及伦理道德、基因转染效率高等特点受到更多的关注,并获得可喜成绩。然而,作为“细胞药物”的干细胞在单独移植到体内受损部位后,均会不同程度地发生急性死亡和偏离目标区域,极大影响BMSCs潜在的治疗效果。 多种生物调节因子可以通过协调和引导各类细胞信号,促进干细胞的增殖和定向分化,其中主要包括碱性成纤维生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、血管生长因子(VEGF)等；此外,以基质胶(Matrigel)构建的三维骨架为载体,利用组织工程学方法进一步改善细胞生长的微环境,据报道可有利于移植细胞的存活和分化。但是,各种生长因子与基质胶的联合应用是否对BMSCs产生协同效应,目前仍然缺乏直接有力的研究依据。 干细胞在体存活的示踪技术中,生物发光成像技术具有良好的准确性和可靠性,它主要利用荧光素酶和底物结合的高特异性,将活细胞独有的化学能转变成为可见光能,通过光子强度与标记细胞数目的正比关系,监测干细胞体内外的增殖和存活情况。具有其他技术不可比拟的高灵敏度、高时间分辨率。 研究目的 1.通过观察不同生长因子(VEGF、bFGF、IGF-1)对BMSCs增殖和凋亡的影响,阐明生长因子及Akt信号通路对BMSCs增殖和凋亡的作用； 2.通过报告基因成像技术活体动态长程观察不同生长因子(VEGF、bFGF、IGF-1)联合基质胶对BMSCs移植后体内存活增殖的作用,并初步探讨其机制。 实验方法 第一部分：BMSCs的分离、培养、鉴定及生长因子对其在体外的增殖影响 1.分离培养B-actin-luc FVB转基因小鼠来源的BMSCs,并采用贴壁筛选法进一步纯化,通过细胞表面标志物(APC-CD90(+)、PE-CD44(+)、PE-CD34(-)和PE-CD45(-))进行细胞流式分析鉴定； 2.培养至第3代的BMSCs,分别加入VEGF、bFGF、IGF-1 (20ng/ml,72h);利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色实验检测各组BMSCs的增殖能力；TUNEL法染色实验检测各组BMSCs的体外凋亡情况；Western -blot方法检测各组BMSCs中Akt及pAkt蛋白表达水平。 第二部分：生长因子联合Matrigel对BMSCs在体的增殖影响 1. BMSCs分离培养鉴定方法同第一部分； 2.利用IVIS小动物活体成像系统观察细胞数量与光学信号强度的关系,确定移植细胞数量 3.将既定移植细胞数量与20μl基质胶、20nng生长因子混合后,种植在B-Actin-luc FVB转基因小鼠的近交系小鼠背部皮下；利用小动物活体成像系统观察移植后既定时间点各组信号表达情况； 4.取第3周细胞移植组织标本,TUNEL法检测移植组织细胞凋亡情况；Western-blot方法检测移植组织Akt及p-Akt蛋白表达水平。 结果 第一部分：BMSCs的分离、培养、鉴定及生长因子对其在体外的增殖影响 1.通过细胞表面标志物鉴定确定所培养细胞为BMSCs; 2.MTT结果显示,与对照组相比,bFGF(0.1051±0.01512%vs0.0671±0.01745%,P0.05)：IGF-1(0.10436±0.01252%vs0.0671±0.01745%,P0.05)均可明显促进BMSCs增殖； 3. TUNEL结果显示,与对照组相比,bFGF(44.0±2.0%vs 56.0±3.7%,P0.05)、IGF-1(36.3±3.2% vs 56.0±3.7%,P0.05)可以抑制BMSCs凋亡； 4. Western-blot结果显示,对照组相比,B+bFGF组(0.47±0.0306 vs 0.28±0.0378,p0.05)、B+IGF-1组(0.57±0.0200 vs 0.28±0.0378,p0.05)的pAkt蛋白表达水平明显增高。 第二部分：生长因子联合Matrigel对BMSCs在体的增殖影响 1.通过IVIS成像系统检测,定量分析到Fluc的光学信号强度与细胞数量呈线性相关； 2. IVIS成像结果显示,移植后第5周(B+M+I)组细胞存活率明显高于其他实验组(B+M+I：21%,其他组均10%) (p0.05)； 3. TUNEL结果显示,与对照组相比,B+M+b组(32.00±1.63%vs42.33±2.05%,P0.05),B+M+I组(26.66±1.69% vs 42.33±2.05%,P0.05)凋亡率明显降低； 4. Western-blot结果显示,与对照组相比,B+M+b组(0.49±0.032 vs0.33±0.0153,p0.05)和B+M+I组(0.63±0.025 vs 0.33±0.0153,p0.05),pAkt蛋白表达水平显著增高。 结论 1.bFGF、IGF-1与VEGF相比,明显促进BMSCs增殖和抗凋亡； 2.在体分子影像研究进一步证实IGF-1联合Matrigel能够明显促进移植BMSCs增殖,并抑制其凋亡； 3.IGF-1联合Matrigel发挥协同作用可能与Akt信号转导通路活化相关。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R329
【共引文献】
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