SUMO-1调控低氧诱导因子-1a在低氧诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

发布时间：2019-06-13 09:56

【摘要】：【目的】研究低氧对体外培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）增殖的影响，以及在低氧情况下PASMCs中的SUMO-1、HIF-1α及其下游靶基因VEGF的表达变化规律及相互关系；探讨SUMO-1对HIF-1α和VEGF基因表达的影响以及它们在低氧所致的PASMCs增殖中的作用，进而参与低氧性肺动脉高压（HPH）的发生发展，为HPH发病机制提供新的理论依据。 【方法】实验共分三个部分。(1)分离大鼠PASMCs并低氧处理：组织贴壁法分离并原代培养雄性SD大鼠PASMCs，光镜下观察细胞的形态，并通过透视电镜以及α-SM-actin的免疫细胞学法进行鉴定。将2-3代对数生长期的细胞置于37℃，含有1%O2、5%CO2、94%N2的三气培养箱中，处理不同的时间复制体外大鼠HPH分子模型。(2)检测低氧对大鼠PASMCs的影响：将细胞分别在常氧和（或）低氧情况下处理2h、6h、12h、24h、48h，用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法和增殖细胞核抗原（PCNA）的免疫细胞化学法检测低氧对细胞增殖的影响。同样方法将细胞分为常氧对照组和缺氧2h、6h、12h、24h组，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法和Western blo（tWB）法分别检测PASMCs中SUMO-1、HIF-1α和VEGF mRNA和蛋白的表达水平。免疫细胞荧光法分别检测常氧及低氧情况下SUMO-1和HIF-1α在PASMCs中的表达情况。(3)用携带SUMO-1基因的慢病毒干预大鼠PASMCs，检测低氧对PASMCs的影响：构建携带有siRNA和真核表达SMUO-1的慢病毒，感染至PASMCs中，将细胞随机分为空白对照组、空载病毒组、沉默SUMO-1组（SUMO-1-RNAi-LV）和真核表达SUMO-1组（SUMO-1-LV），将上述几组分别在低氧情况下处理0h、2h、6h、12h、24h、48h，Brdu渗入法检测低氧对各组PASMCs的增殖的影响。再将上述各组分别常氧和缺氧处理12h，RT-PCR和WB法分别检测SUMO-1、HIF-1α和VEGF mRNA和蛋白表达情况。 【结果】 1.分离大鼠PASMCs并鉴定： （1）组织块贴壁法成功分离出雄性大鼠PASMCs。用含1%青霉素-链霉素、15%胎牛血清的DMEM/F12培养基原代培养，3-5d后有少量细胞从组织块周围游离出来，7-10d后细胞融合成片，呈典型“峰-谷”状分布，消化传代至第3代； （2）倒置相差显微镜下，PASMCs呈长梭形放射状生长，细胞中心有卵圆形细胞核。细胞铺满瓶壁时，形成“峰—谷”状表现。 （3）α-SM-actin的免疫细胞化学显示，细胞质中有较多与细胞纵轴相平行的丝状物被染成棕黄色，阳性率达到96%以上；免疫细胞荧光显示，胞浆中有较强的红色荧光，呈与细胞纵轴平行的丝状排列，而细胞核未着色；均表明为大鼠PASMCs。 （4）透视电镜下，可见细胞及胞核均呈长梭形，异染色质多；胞浆内有许多与细胞纵轴平行的肌丝，大量胞饮，肌膜下有少量密斑和密体，缺乏高尔基体。 2．低氧对大鼠PASMCs的影响： （1）MTT比色法结果：常氧和低氧情况下，随着时间的递增，大鼠PASMCs的吸光度（A值）亦逐渐增加，且各时间点缺氧组A值均高于相对应的常氧组。比较缺氧组之间的差异显示：A值在缺氧12h组开始明显增高（p＜0.05），缺氧24h组达到高峰值（p＜0.05），而缺氧48h组进入平台期。 （2）PCNA的免疫细胞化学法结果：随着缺氧时间的递增，PASMCs中的阳性细胞逐渐增多。且阳性细胞比率在缺氧12h组开始明显增高，与对照组比较有统计学意义（p＜0.05），缺氧24h组达到高峰值（p＜0.05），而缺氧48h组进入平台期。 （3）大鼠PASMCs中的SUMO-1、VEGF mRNA在缺氧2h组表达明显增多（p＜0.05），缺氧12h组达高峰（p＜0.05），缺氧24h组趋于平台期；HIF-1α mRNA表达随着缺氧时间的递增而增加，但与对照组比较差异无显著性（P＞0.05）。 （4）大鼠PASMCs中的SUMO-1、HIF-1α、VEGF蛋白表达均随着缺氧时间的递增而增加，且在缺氧12h组达到高峰值（p＜0.05），缺氧24h组趋于平台期。 （5）常氧和低氧时SUMO-1均表达于大鼠PASMCs的细胞核中；而HIF-1α在常氧情况下少量表达于细胞质中，低氧时明显表达于细胞核中。 3. SUMO-1基因干预后，低氧对大鼠PASMCs的影响： （1）Brdu渗入法结果显示：随着缺氧时间的递增，各组大鼠PASMCs中的阳性细胞比率均逐渐增高。SUMO-1-RNAi-LV组的阳性细胞比率均低于相应各组，缺氧12h、24h、48h时，其阳性率和相应各组之间的差异有均统计学意义（p＜0.05）；而SUMO-1-LV组的阳性细胞比率均高于相应各组，缺氧6h、12h、24h、48h时，其阳性率和相应各组之间的差异均有统计学意义（p＜0.05）。 （2）大鼠PASMCs中的HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白，在SUMO-1-RNAi-LV组均明显低于相应对照组（均P＜0.05）、在SUMO-1-LV组均明显高于相应对照组（均P＜0.05），而且这种差异在低氧情况下更显著（P＜0.05）。 【结论】 1.低氧可明显促进体外原代培养的大鼠PASMCs的增殖。 2.低氧情况下，HIF-1α由大鼠PASMCs的细胞质移至细胞核内，而细胞核内稳定表达的SUMO-1可能参与改变HIF-1α的转录活性与稳定性。 3.低氧诱导大鼠PASMCs中的SUMO-1介导HIF-1α发生SUMO化，上调HIF-1α的转录活性及稳定性，导致HIF-1α下游靶基因VEGF等转录激活，进而参与大鼠PASMCs的低氧性增殖。
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【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

【参考文献】

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本文编号：2498446