MicroRNAs对细胞信号转导调控的研究

发布时间：2019-06-12 19:53

【摘要】：随着人类生活水平和生存环境的改变,代谢与内分泌疾病的发病率逐年上升。糖尿病是其中最常见的一种慢性疾病,其主要特征是血糖代谢的紊乱,分为Ⅰ型及Ⅱ型糖尿病,临床上95%以上患者为Ⅱ型糖尿病(T2DM)。近年来的研究发现Ⅱ型糖尿病发病的主要原因是胰岛素抵抗,其贯穿于Ⅱ型糖尿病的整个过程。虽然多项研究结果提示胰岛素抵抗与激素因子、炎症反应及内质网应激等共同作用有关,但关于胰岛素抵抗的具体机制尚不明确。MicroRNAs (miRNAs)是一大类进化保守的小分子非编码RNAs,典型的miRNAs由20-25个单核苷酸组成,miRNAs可通过序列特异性的方式与特定靶基因的3’端非编码区(3’UTR)相互作用来调节靶基因的蛋白表达,从而发挥其生物学功能。许多miRNA与Ⅱ型糖尿病的发展有着密切的关系。Zampetaki等监测到,健康人且后来发生糖尿病的那些患者其血浆中有多种miRNAs的水平逐渐发生变化,如microRNA-126(miR-126)在糖尿病人血浆中的含量明显减少。因此,我们认为miR-126与Ⅱ型糖尿病的发生、发展可能有密切关系。鉴于目前miR-126与Ⅱ型糖尿病发病机制尚不明确,本课题在INS-1细胞(大鼠胰岛β细胞株)应用miRNA的过/低表达及功能研究等方法,探讨了miR-126对胰岛素信号通路的调控作用及机制。 目的 本课题旨在研究miR-126对INS-1细胞胰岛素信号通路的调控作用及机制,为Ⅱ型糖尿病的发生、发展提供新的理论基础及潜在的治疗靶点。 方法 生物信息学方法预测miR-126的潜在靶基因。以培养的INS-1细胞为模型,将人工合成的miR-126模拟物进行转染,并用实时荧光定量PCR方法及荧光显微镜检测转染效率。转染48小时后的INS-1细胞用人工合成胰岛素(100nM)刺激12小时,提取细胞总蛋白进行BCA蛋白定量。利用Western Blot方法检测miR-126对预测靶基因蛋白表达的影响;利用MTT法检测miR-126对INS-1细胞增殖的影响。 结果 通过生物信息学检索PicTar、BibiServ等软件发现:在胰岛素受体底物-1(IRS-1)及PIK3R2 mRNA的3’非翻译区(3’UTR)存在miR-126的潜在结合位点,二者与miR-126结合自由能分别为?19.3和?19.4 kcal/mol,提示miR-126可能调控IRS-1及PIK3R2 mRNA的表达。为了干预内源性miRNA的表达,我们将人工合成miR-126模拟物转染INS-1细胞48小时,定量PCR结果显示:人工合成的miRNA模拟物在体外可有效调节内源性miRNA的表达。为进一步证明IRS-1和PIK3R2是miR-126的靶点,我们将INS-1细胞分别转染miR-126 mimics、miR-126 mutation、miRNA control mimics或Si-IRS1 48小时后用100nM胰岛素刺激12小时,Western blot结果显示:转染miR-126 mimics以及Si-IRS1组IRS-1、PIK3R2及Akt蛋白表达明显下调。另外,我们用100nM胰岛素不同时间段(0分钟、1分钟、5分钟、10分钟、30分钟、60分钟)刺激INS-1细胞,用Western blot方法检测Akt蛋白磷酸化水平,结果显示:胰岛素可时间依赖性促进INS-1细胞Akt磷酸化效应,而Akt蛋白表达无明显变化。另外,为进一步探讨miR-126与INS-1细胞功能的关系,我们将INS-1细胞分别转染miR-126 mimics、miRNA control mimics(CTm)或Si-IRS1 48小时后用100nM胰岛素刺激12小时,利用MTT法检测INS-1细胞的增殖情况,结果显示:与对照组相比,过表达miR-126组INS-1细胞的增殖明显受到抑制,其抑制率达30.05%。 结论 IRS-1和PIK3R2 mRNA是miR-126的靶点,miR-126通过作用于IRS-1及PIK3R2基因3’端非编码区上特异性靶序列抑制INS-1细胞IRS-1、PIK3R2及下游Akt蛋白的表达;胰岛素可时间依赖性促进INS-1细胞Akt磷酸化效应;miR-126可能以IRS-1及PIK3R2为靶点抑制IRS-1/PI3K/Akt信号通路,从而抑制INS-1细胞的增殖。 炎症反应贯穿于动脉粥样硬化的各个阶段。其初期特征是白细胞的聚集和内皮细胞(ECs)的激活。MicroRNAs(miRNAs)是一大类进化保守的小分子非编码RNAs,典型的miRNA由20-25个单核苷酸组成,miRNAs可通过序列特异性的方式与特定靶基因的3’端非编码区(3’UTR)相互作用来调节基因表达,然而miRNAs与内皮功能的关联尚不清楚。本课题组前期研究发现miR-155和miR-221/222在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)以及血管平滑肌细胞(VSMCs)高度表达。Ets-1是与炎症及血管腔形成联系密切的一种重要转录因子,通过生物信息学检索发现:ETS-1 mRNA的3’非翻译区存在miR-155和miR-221/222的潜在结合位点;Western blot实验也证明:在HUVECs中miR-155和miR-221以ETS-1为靶点发挥对靶基因的调控作用;另外,血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)也是miR-155的靶点。定量PCR结果显示:HUVECs中血管紧张素Ⅱ(AngII)刺激Ets-1及其下游基因(包括VCAM1, MCP1 and FLT1)表达上调,这种作用可部分被miR-155及miR-221/222的过表达逆转;miR-155以AT1R为靶点,可减少AngII引起的HUVECs细胞迁移。总之,我们的研究发现HUVECs高表达的miR-155可能以AT1R及Ets-1为共同靶点,而miR-221/222则以Ets-1为靶点,它们对内皮细胞多种炎症分子的表达起调节作用,并且可调节HUVECs的迁移。这些结果为动脉粥样硬化提供了新的理论依据及潜在治疗靶点。
[Abstract]:With the change of human living standard and living environment, the incidence of metabolic and endocrine diseases is increasing year by year. Diabetes is one of the most common chronic diseases, which is mainly characterized by the disorder of blood glucose metabolism, which is divided into type I and type II diabetes, and more than 95% of the patients are type II diabetes mellitus (T2DM). In recent years, it has been found that the main cause of type 鈪，

本文编号：2498262