大鼠胚胎干细胞系的建立及向神经干细胞分化潜能的研究

发布时间：2019-06-24 17:13

【摘要】：大鼠是一种非常有价值的研究病理和药理的模型动物。因此建立一种稳定的大鼠胚胎干细胞(rES)分化体系对于分析rES早期发育、基因功能以及应用于基因打靶制作人类疾病动物模型非常必要。尽管具有生殖系遗传能力的rES细胞系已经被成功建立,维持其自我更新和保持其未分化的状态的各种分子网络已经被很好的揭示,但是,rES细胞向三胚层分化体系和方法的相关研究甚少。中枢神经系统退行性疾病严重危害着人类的健康,ES细胞有希望为神经系统疾病细胞替代性治疗提供细胞来源。到目前为止,尚无关于自体rES细胞获得神经干细胞(NS)的报道。研究rES细胞的神经分化过程,建立从全能性细胞向神经细胞诱导分化过程,获得具有NS细胞特性的神经前体细胞,不仅为疾病细胞治疗的实验研究提供理论基础,而且为神经系统早期发育的研究提供良好的模型。此研究拟通过建立rES细胞系,对其建立稳定的体外分化体系,进而诱导分化为具有自我更新和多项分化潜能的NS细胞。希望能为大鼠神经系统发育过程的研究平台,药理检测及神经疾病模型的建立提供理论依据。经过研究得到以下实验结果： 1)本研究取孕E14.5DA大鼠胚胎脑组织细胞,在体外无血清条件下(N2B27添加bFGF和mEGF生长因子)进行培养,获取可以以单层贴壁细胞和悬浮神经球的状态进行传代培养rNS。细胞免疫荧光检测结果显示NS细胞表面标志Nestin、Olig2、Pax6、呈阳性；大部分rNS表达MKi-67,证明rNS处于增殖旺盛的状态。神经元祖细胞的表面标志Dcx的表达率为0.8%,初步说明其有能够向神经元分化的潜能。 2)利用rNS细胞分化培养基对rNS进行体外分化,10d左右,细胞免疫荧光结果显示三种神经细胞系的表面标志Tuj1、GFAP和04的表达为阳性,说明rNS细胞能够分化为神经元,星形胶质细胞和少突胶质细胞。对其进一步进行分化,进行细胞免疫荧光检测发现神经元亚型标志物MAP2、GABA和ChAT表达为阳性,说明此rNS细胞具有向不同神经元亚型分化的能力。综合以上两点初步确定我们从大鼠脑组织分离培养的细胞为NS细胞。 3)利用2i体系的rES细胞培养基进行培养,获得10个稳定传代的rES细胞系,共培养了30代,没有观察到明显的分化迹象。对DA5-3rES细胞进行了碱性磷酸酶染色(APStaining)发现为AP呈阳性,RT-PCR检测进一步发现DA5-3rES表达Oct4、Sox2、Nanog、Rex-1、fgf4和Eras多能性基因。细胞免疫荧光染色结果表明DA5-3rES细胞表达Oct4、Sox2和SSEA-1多能性因子,核型分析结果显示,有超过75%的细胞染色体条数为42,说明这株DA5-3rES细胞具有自我更新和多向分化的潜能且核型正常。 4)rES在正常含有10%血清(DM)的EB培养基条件下,大部分rES细胞发生凋亡或者坏死,只能形成少数EB(38.37±4.4%)；利用阶段性去除2i的诱导方式,rES在rEFM,CM+2i,及CM的培养条件下顺次分别培养2d,2d,1d,能够形成形态均一,质量良好的EB,说明此rEB诱导体系稳定可行。 5)利用RT-PCR技术检测rEB体外分化的基因表达情况, rEB表达外、中、内三胚层的表面标志基因Nestin、Sox17、Afp、Flk和Gata6; rEB贴壁分化的过程中,第6-15d,能够分化为呈规律性搏动的心肌细胞。由此初步确定rEB具有向三胚层体外分化的能力。 6)利用N2B27培养基对rEB进行体外神经干细胞的分化,在诱导第11d左右形成神经管上皮细胞,挑取克隆进行贴壁培养,形成rNS细胞,细胞免疫荧光结果显示Nestin、 Olig2、Pax6、Sox2呈阳性,大部分rNS细胞表达MKi-67证明rNS细胞处于增殖旺盛的状态。神经元祖细胞的表面标志Dcx的表达率为0.6%,初步说明其有能够向神经元分化的潜能。 7)通过使用rNS细胞分化培养基对rNS进行体外分化,10d左右,细胞免疫荧光检测结果显示三种神经细胞系的表面标志Tuj1、GFAP和04的表达为阳性,说明rNS能够分化为神经元,星形胶质细胞和少突胶质细胞。对其进一步进行分化,检测发现神经元亚型标志物MAP2、TH和GABA表达为阳性,说明此rNS具有向不同神经元亚型分化的能力。 综合以上,DA5-3rES体外分化为神经干细胞体系的建立具有可行性和有效性。
[Abstract]:Rats are a very valuable model animal for the study of pathology and pharmacology. Therefore, it is necessary to establish a stable rat embryonic stem cell (rES) differentiation system for the analysis of the early development of rES, the gene function and the application of the gene targeting to the production of human disease animal models. Although the rES cell line with a reproductive system genetic capacity has been successfully established, various molecular networks that maintain its self-renewal and maintain its undifferentiated state have been well disclosed, but the correlation of the rES cell to the three-germ differentiation system and method is very small. The degenerative disease of the central nervous system is a serious threat to human health, and ES cells are expected to provide a source of cell for alternative treatment of nervous system disease cells. To date, there is no report on autologous rES cells to obtain neural stem cells (NS). To study the process of neural differentiation of rES cells, the process of inducing differentiation from functional cells to nerve cells was established, and the neural precursor cells with NS cell characteristics were obtained, which not only provided a theoretical basis for the experimental study of disease cell therapy, But also provides a good model for the early development of the nervous system. This study is to establish a stable in vitro differentiation system to induce differentiation into NS cells with self-renewal and multiple differentiation potential by establishing a rES cell line. It is desirable to provide a theoretical basis for the establishment of a research platform, a pharmacological test and a neural disease model for the development of the nervous system of the rat. The following experimental results were obtained through the study: 1) In this study, the embryonic brain tissue cells of E14. 5DA rats were cultured and cultured under no serum conditions in vitro (addition of bFGF and mEGF growth factor to N2B27). S. The results showed that the NS cell surface marker, Nestin, Olig2, Pax 6, was positive, most of the rNS expression was Mk-67, and it was proved that the rNS was in the form of vigorous proliferation. The expression rate of the surface marker Dcx of the neuron progenitor cells was 0.8%, indicating that it was able to differentiate into the neurons. (2) The in vitro differentiation of rNS was carried out by using the rNS cell differentiation medium, and the results showed that the expression of the surface markers Tuj1, GFAP and 04 of the three nerve cell lines was positive, indicating that the rNS cells could be differentiated into neurons, astrocytes and oligodendrocytes. It was found that the expression of MAP2, GABA and ChAT of the neuron-type markers was positive, indicating that the rNS cells were differentiated into different neuron subtypes. The ability to separate the cultured cells from the rat brain tissue was preliminarily determined at the above two points. S-cells.3) The rES cell lines of the 2i system were cultured to obtain 10 stable passages of the rES cell line, which was co-cultured for 30 generations and no significant observation was observed. The differentiation of DA5-3rES cells was found to be positive for AP. RT-PCR was used to detect the expression of Oct4, Sox2, Nanog, Rex-1, fgf4, and Eras in DA5-3rES. The results of the cellular immunofluorescent staining show that the DDA5-3rES cells express Oct4, Sox2 and SSEA-1. The results show that the number of the cells with more than 75% of the cells is 42, indicating that the DDA5-3rES cell has the potential of self-renewal and multi-directional differentiation. And the karyotype was normal. (4) in the case of the EB medium containing 10% serum (DM) normally, most of the rES cells had apoptosis or necrosis, only a few of EB (38.37-4.4%) were formed, and the rES was sequentially removed under the conditions of rEFM, CM + 2i and CM under the culture conditions of rEFM, CM + 2i, and CM, respectively. 2 d, 2d and 1d were cultured to form an EB with good morphology and good quality. (5) The expression of rEB in vitro was detected by RT-PCR, and the surface marker genes, Nestin, Sox17, Afp, Flk and Gaata6, were detected by RT-PCR. The primary determination of rEB has a three-phase, three-phase, three-phase, three-dimensional, (6) the differentiation of the in vitro neural stem cells was carried out by using the N2B27 medium, and the neural tube epithelial cells were formed on the left and right of the induction of the 11th day, and the clones were selected for adherent culture to form the rNS cells, and the result of the immunofluorescence of the cells showed that the Nestin, Oli2, P ax6, Sox2 were positive, most of the rNS cells expressed MKi-67 to demonstrate the rNS The expression rate of the surface marker Dcx of the neuron progenitor cells was 0.6%. 7) In vitro differentiation of the rNS by using the rNS cell differentiation medium, the expression of the surface markers Tuj1, GFAP and 04 of the three nerve cell lines is positive, indicating that the rNS can be differentiated into neurons, Astrocytes and oligodendrocytes were further differentiated, and the expression of MAP2, TH and GABA was found to be positive for neuronal subtype markers, indicating that this rNS had In vitro, the differentiation of DA5-3rES into neural stem cells in vitro
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329

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本文编号：2505227