ELMO1对巨噬细胞的吞噬作用及炎症反应中相关因子表达的影响

发布时间：2017-03-15 22:07

  本文关键词：ELMO1对巨噬细胞的吞噬作用及炎症反应中相关因子表达的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：ELMO1(Engulfment and cell motility protein 1,ELMO1)基因位于人第七号染色体上,在小鼠细胞内定位在第十三号染色体,编码的ELMO1蛋白在细胞的迁移和吞噬过程中扮演着重要的角色,失控的细胞迁移和吞噬会导致炎症相关疾病的发生甚至肿瘤转移。巨噬细胞由来源于骨髓的单核细胞分化而来,机体所有组织中都有这种细胞的存在,且它还是造血系统中可塑性最强的一种免疫细胞。巨噬细胞既是机体非特异性免疫的重要组成细胞,也在特异性免疫反应中有着呈递抗原的作用,是体内一种具有多种功能和用途的细胞,这些多样性功能赋予它在正常发育、体内平衡、组织修复和对病原菌的免疫反应中有不同作用。在非特异性免疫中,它能通过吞噬作用除去机体中侵入的病原菌和死细胞以及碎片;在特异性免疫反应中摄取并递呈外援性异物,通过分泌细胞因子和趋化因子诱导和调节免疫应答。几乎每一种人类疾病都涉及到巨噬细胞,它们也被作为主要的治疗目标,因为它们的这些多样性功能可以被定向的加强或抑制,以改变疾病的结果。LPS刺激巨噬细胞后,通过TLR4受体激活调控细胞内炎症因子相关基因的表达。ELMO1基因参与细胞的迁移和吞噬作用,而巨噬细胞在机体的固有免疫和适应性免疫中发挥重要作用,为了探究ELMO1是否可以调节巨噬细胞的吞噬作用和分泌功能,以及涉及到哪些分子机制。首先,实验室通过构建了ELMO1基因的干涉载体PLVX-sh RNA及其对照质粒,包被慢病毒后感染RAW264.7细胞系,扩大培养后用流式细胞仪分选出稳定表达的细胞系,采用镜下观察细胞形态,然后用稳定表达细胞系的细胞去吞噬标记荧光标签的大肠杆菌颗粒,流式细胞仪分析吞噬效率。然后,本实验室成功建立ELMO1基因敲除小鼠,从小鼠腹腔取得原代巨噬细胞或者由小鼠骨髓细胞诱导分化而来的巨噬细胞先用流式细胞仪检测纯度或分化效率,再通过吞噬指数法去检测野生型和敲除型吞噬效率,并从蛋白水平检测LPS刺激后炎症因子的表达情况。结果表明:ELMO1基因表达降低后细胞的吞噬能力变弱;在小鼠的原代巨噬细胞中,敲除型细胞内Dock2表达明显降低,细胞的吞噬能力无明显变化,可能是由于ELMO1敲除后细胞内ELMO蛋白的另一种亚型ELMO2蛋白表达升高引起的。LPS刺激巨噬细胞后,炎症因子TNF-a和IL-6的分泌在统计学上无显著性差异,但由实验结果可知ELMO1敲除后炎症因子产生的绝对量相对增加。ELMO1基因在巨噬细胞内与Dock2结合形成复合物行使功能,ELMO对原代巨噬细胞的吞噬影响有待进一步验证。
【关键词】：ELMO1 RAW264.7细胞 原代巨噬细胞 吞噬作用 炎症因子
【学位授予单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 缩略词表8-11
• 第一部分 引言11-21
• 1 研究背景11-18
• 1.1 免疫细胞与吞噬11
• 1.2 细胞趋化性研究11-13
• 1.3 细胞吞噬的研究13-16
• 1.4 吞噬与炎症16-18
• 2 研究意义和实验设计18-21
• 2.1 研究目的和意义18-19
• 2.2 实验设计19-21
• 第二部分 ELMO1对巨噬细胞系RAW264.7 的吞噬作用研究21-39
• 1 实验材料21-24
• 1.1 实验质粒、细菌及细胞21
• 1.2 siRNA21-22
• 1.3 实验主要仪器22-23
• 1.4 实验主要试剂耗材及配方23-24
• 2 实验方法24-32
• 2.1 RAW264.7 细胞系培养24-25
• 2.2 ELMO1 shRNA重组质粒的构建与鉴定25-29
• 2.3 Western blot检测29
• 2.4 病毒质粒的包被及鉴定29-30
• 2.5 稳定转基因细胞株的筛选30-31
• 2.6 吞噬实验31
• 2.7 统计学分析31-32
• 3 实验结果32-35
• 3.1 pLVX-shRNA-ELMO1i重组干扰质粒的酶切鉴定32-33
• 3.2 Western Blot检测重组质粒的干扰水平33-34
• 3.3 稳定转染细胞系筛选34
• 3.4 ELMO1对RAW264.7 细胞吞噬能力的影响34-35
• 4 讨论35-39
• 第三部分 ELMO1对原代巨噬细胞的吞噬作用研究39-53
• 1 实验材料39-41
• 1.1 实验细胞及实验小鼠39
• 1.2 引物39
• 1.3 实验主要仪器39-40
• 1.4 实验主要试剂40-41
• 2 实验方法41-45
• 2.1 小鼠基因型鉴定41-42
• 2.2 小鼠ELMO1基因敲除后蛋白表达鉴定42
• 2.3 巨噬细胞的分离、培养及纯度检测42-43
• 2.4 ELISA检测炎症因子43-44
• 2.5 LPS刺激巨噬细胞44
• 2.6 Western Blot检测细胞内ELMO1、ELMO2、Dock2蛋白的表达44
• 2.7 吞噬指数实验44-45
• 3 实验结果45-50
• 3.1 小鼠基因型鉴定结果45-46
• 3.2 ELMO1敲除小鼠蛋白鉴定结果46-47
• 3.3 巨噬细胞分离纯度及分化效率47-48
• 3.4 LPS刺激巨噬细胞后分泌炎症因子检测48
• 3.5 敲除ELMO1基因对原代巨噬细胞吞噬的影响48-50
• 3.6 ELMO1对巨噬细胞内相关蛋白表达的影响50
• 4 讨论50-53
• 结论53-55
• 参考文献55-61
• 致谢61-63
• 攻读学位期间发表的学术论文目录63-64

【共引文献】

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