结核分枝杆菌转录抑制因子SirR参与胁迫应答和转录调控

发布时间：2017-03-16 02:01

  本文关键词：结核分枝杆菌转录抑制因子SirR参与胁迫应答和转录调控，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：结核病(Tuberculosis,TB)仍然威胁着全球人类的健康,2014年新增感染病例900万,150万人死于结核病,成为仅次于艾滋病的全球第二大传染疾病(http://www.who.int/tb/publications/global_report/en/)。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)是引起结核病的病原菌,它能够在宿主巨噬细胞内持留,持留结核分枝杆菌可以逃避宿主免疫系统的杀伤作用以及抗结核药物。近年来,由于多重耐药(multidrug-resistant,MDR)、广泛耐药(extensively drug-resistant,XDR)甚至是完全耐药(totally drug resistant tuberculosis,TDR)MTB的出现,MTB与HIV共感染增加,再加上缺乏抗结核新药和疫苗,结核病形势变得更加严峻。因此,对于结核分枝杆菌致病机理的研究迫在眉睫。结核分枝杆菌能够通过多种机制逃逸宿主免疫系统的杀伤,适应不利环境。除了细胞壁含有独特的蜡质分枝菌酸,具有高度不透性,以及多种外排泵之外,结核分枝杆菌具有复杂的转录调控网络。金属调控蛋白通过控制细菌中与金属离子吸收,储存和外排相关基因的表达,从而维持细菌金属离子代谢的稳定,其中DtxR(diphtheria toxin repressor)家族是最具有代表性的金属调控蛋白之一。结核分枝杆菌中,DtxR家族包括两个成员:IdeR(iron dependent repressor)和SirR(iron repressor),本课题主要以SirR为研究对象开展实验。SirR最初发现于金黄色葡萄球菌,作为转录抑制因子,控制毒力基因的表达。结核分枝杆菌中,SirR由Rv2788编码,由于SirR的转录调控依赖锰离子,并且调控与锰离子吸收相关的转运蛋白,被重命名为MntR。为了研究Rv2788蛋白在胁迫应答中的作用,我们分别构建了能够表达Rv2788蛋白的重组耻垢分枝杆菌(Ms_Rv2788)以及空载体重组耻垢分枝杆菌(Ms_Vec)。研究发现,Rv2788蛋白没有影响重组耻垢分枝杆菌的生长速率,但改变了菌落形态。通过体外模拟耻垢分枝杆菌侵染巨噬细胞时面临的压力条件,发现Rv2788增强重组耻垢分枝杆菌的抗压能力,对双氧水、联氨氧化压力,SDS表面活性剂和酸性压力更加耐受,同时增强了氯霉素、万古霉素和阿米卡星处理后的存活能力。GC-MS分析细胞壁的脂肪酸组分,发现重组菌Ms_Rv2788的脂肪酸成分明显上调,特别是C14:1w5(t),C14:0和C16:1w7(c)。通过检测溴化乙锭和尼罗红的积累,发现Rv2788蛋白降低了重组耻垢分枝杆菌细胞壁的通透性。这说明Ms_Rv2788可能通过改变细胞壁的脂肪酸组分降低细胞壁的通透性,进而增强对环境压力以及抗生素的耐受能力。但是,我们发现了一个特殊现象:与空载菌相比,重组菌Ms_Rv2788对卷曲霉素更加敏感。荧光定量PCR检测与卷曲霉素耐受相关基因的转录水平,发现Rv0039,Rv0812,Rv1286三个基因的转录水平明显下调,这表明Rv2788调控卷曲霉素耐受相关基因增强了耻垢分枝杆菌对卷曲霉素的敏感性。此外,荧光定量PCR检测了Rv2788的转录调控作用可能调控靶基因的转录水平,结果发现whiB1,Rv0077,Rv2221,Rv2986和Rv1219五个基因的转录水平下调,而SOS反应相关基因lexA则明显上调表达。通过凝胶电泳实验(EMSA)检测到Rv2788能够与上述下调基因的启动子片段结合,这说明Rv2788直接调控这些基因的转录水平。综上所述,本文主要研究了转录抑制因子Rv2788在压力胁迫和转录调控中发挥的功能,首次报道了Rv2788可能直接或间接参与分枝杆菌脂肪酸代谢,改变细胞壁的脂肪酸成分和菌落形态,降低细胞壁的通透性,增强耻垢分枝杆菌的抗压能力;调控卷曲霉素耐受相关基因的转录,增强耻垢分枝杆菌对卷曲霉素的敏感性;负调控多个基因,包括与细胞壁合成相关的基因whiB1和lexA。然而,Rv2788蛋白改变分枝杆菌细胞壁脂肪酸组分和细胞壁的通透性的分子机制,以及下调基因与胁迫应答之间的的关系还有待进一步研究。
【关键词】：结核分枝杆菌 SirR 胁迫应答 细胞壁 转录调控
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378.911
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 第1章 综述10-17
• 1.1 前言10
• 1.2 细菌中铁离子依赖的调控作用10-11
• 1.3 铁离子调控在感染中的作用11
• 1.4 分枝杆菌中铁离子的调控11-12
• 1.5 结核分枝杆菌的金属依赖调控蛋白FurA和FurB12-13
• 1.6 IdeR蛋白13-16
• 1.6.1 IdeR与铁离子代谢调控13-15
• 1.6.2 IdeR与分枝杆菌氧化应激反应15
• 1.6.3 IdeR与活性氮氧化压力15-16
• 1.7 SirR蛋白16
• 1.8 总结16-17
• 第2章 引言17-19
• 第3章 实验材料和方法19-34
• 3.1 实验材料19-22
• 3.1.1 实验菌株和质粒19
• 3.1.2 主要试剂和溶液19-21
• 3.1.3 主要培养基21-22
• 3.1.4 主要仪器22
• 3.2 实验方法22-34
• 3.2.1 构建表达Rv2788基因的重组耻垢分枝杆菌22-27
• 3.2.2 Rv2788基因在大肠杆菌中的克隆表达与纯化27-28
• 3.2.3 生长曲线的测定28
• 3.2.4 菌落形态观察和滑动实验28-29
• 3.2.5 体外分析重组耻垢分枝杆菌在不同压力胁迫下的生存能力29
• 3.2.6 重组耻垢分枝杆菌对抗结核药物耐药性分析29-30
• 3.2.7 重组耻垢分枝杆菌脂肪酸的测定30-31
• 3.2.8 重组耻垢分枝杆菌对溴化乙锭和尼罗红的吸收分析31
• 3.2.9 Rv2788的转录调控分析31-32
• 3.2.10 数据处理与分析32-34
• 第4章 结果与分析34-51
• 4.1 成功构建表达Rv2788基因的重组耻垢分枝杆菌34-36
• 4.1.1 体外扩增结核分枝杆菌Rv2788基因34
• 4.1.2 成功构建重组耻垢分枝杆菌Ms_Rv278834-35
• 4.1.3 Rv2788重组蛋白在耻垢分枝杆菌中成功表达35-36
• 4.2 Rv2788重组蛋白在大肠杆菌BL21中的表达与纯化36
• 4.3 Rv2788重组蛋白不影响耻垢分枝杆菌的生长速率36-37
• 4.4 Rv2788过表达改变重组耻垢分枝杆菌的菌落形态37-38
• 4.5 Rv2788过表达对重组耻垢分枝杆菌的滑动能力无明显影响38-39
• 4.6 Rv2788过表达改变重组耻垢分枝杆菌细胞壁的脂肪酸组分39
• 4.7 Rv2788增强重组耻垢分枝杆菌的抗压能力39-43
• 4.7.1 Rv2788过表达增强重组耻垢分枝杆菌对过氧化氢（H_2O_2）的耐受40
• 4.7.2 Rv2788过表达增强重组耻垢分枝杆菌对联氨的耐受40-41
• 4.7.3 Rv2788过表达增强重组耻垢分枝杆菌对表面活性物质SDS的耐受41-42
• 4.7.4 Rv2788过表达增强重组耻垢分枝杆菌对酸性压力的耐受42-43
• 4.7.5 Rv2788过表达不影响耻垢分枝杆菌在营养饥饿条件下的存活43
• 4.8 Rv2788增强耻垢分枝杆菌对抗生素的耐受能力43-45
• 4.9 Rv2788改变耻垢分枝杆菌细胞壁的通透性45
• 4.10 Rv2788增强耻垢分枝杆菌对卷曲霉素的敏感性45-46
• 4.11 Rv2788下调卷曲霉素相关基因的的转录水平46-48
• 4.12 Rv2788蛋白的转录调控分析48-51
• 4.12.1 Rv2788蛋白负调控可能的靶基因48-50
• 4.12.2 Rv2788蛋白正调控lexA基因的表达50-51
• 第5章 结果与讨论51-54
• 参考文献54-62
• 致谢62-64
• 硕士期间发表和撰写的文章64

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1 徐苗,陈保文,沈小兵,苏城,罗永艾,王国治;耻垢分枝杆菌作为免疫调节剂的研究[J];中华微生物学和免疫学杂志;2005年09期

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本文编号：251205