温敏型生物降解水凝胶载体防龋基因疫苗不同途径免疫SD大鼠的实验研究

发布时间：2019-07-13 10:17

【摘要】：目的：使用生物降解水凝胶P(CL-GA)-PEG-P(CL-GA)作为载体的防龋基因疫苗pVAX1-spap/A、pVAX1-gtfB/CAT、pVAX1-spap/A-gtfB/CAT经股四头肌注射、颌下腺周注射、鼻粘膜滴注及口服四种不同途径免疫SD大鼠,观察免疫效果,探索水凝胶作为防龋疫苗缓释系统的体系组成及应用。 方法：本研究包括三个部分： 实验一：重组质粒pVAX1-spap/A、pVAX1-gtfB/CAT、pVAX1-spap/A-gtfB/CAT及空载体质粒pVAZX1的鉴定和大量制备。先小量抽提重组质粒pVAX1-spap/A、pVAX1-gtfB/CAT、pVAX1-spap/A-gtfB/CAT及空载体质粒pVAX1。并经限制性内切酶酶切、凝胶电泳鉴定。在鉴定正确后,大量抽提重组质粒并计算其浓度和纯度,保存以备免疫动物。 实验二：温敏型生物降解水凝胶P(CL-GA)-PEG-P(CL-GA)表面形态的扫描电镜(SEM)观察,并对其温敏性进行检测和防龋基因疫苗pVAX1-spap/A、pVAX1-gtfB/CAT、pVAX1-spap/A-gtfB/CAT在以水凝胶P(CL-GA)-PEG-P(CL-GA)为载体条件下的体外释放研究。实验三：生物降解水凝胶P(CL-GA)-PEG-P(CL-GA)作为载体的重组质粒pVAX1-spap/A、pVAX1-gtfB/CAT、pVAX1-spap/A-gtfB/CAT及空载体质粒pVAX1免疫SD大鼠。出生21天的雄性SD大鼠90只,随机分为15组：A组:pVAX1-spap/A股四头肌注射组；B组：pVAX1-spap/A颌下腺注射组；C组：pVAX1-spap/A鼻腔滴注组;D组：pVAX1-spap/A口服组；E组：pVAX1-gtfB/CAT股四头肌注射组;F组：pVAX1-gtfB/CAT颌下腺注射组；G组：pVAX1-gtfB/CAT鼻腔滴注组；H组：pVAX1-gtfB/CAT口服组；I组：pVAX1-spap/A-gtfB/CAT股四头肌注射组；J组：pVAX1-spap/A-gtfB/CAT颌下腺注射组；K组：pVAX1-spap/A-gtfB/CAT鼻腔滴注组;L组：pVAX1-spap/A-gtfB/CAT口服组；M组(阴性对照组)：空载质粒pVAX1股四头肌注射组；N组(阴性对照组)：空载质粒pVAX1+水凝胶口服组；O组(空白对照组)：生理盐水股四头肌注射组；建立龋齿模型；每只SD大鼠按照确定的免疫途径进行免疫,每次剂量为100μg/只,股四头肌注射组、颌下腺注射组和鼻腔滴注组每侧各50μg,对照组M、N、O组遵循上述剂量,第28天开始免疫,每周一次,连续免疫三周；样本采集从免疫开始前一天开始,每周采集一次；处死动物后,称重,解剖分离其心、肝、脾、肺、肾、股四头肌、颌下腺、胃等脏器,进行病理检查；取上下颌骨,进行龋损评定,根据Keyes经典评分方法进行评估；采用酶联免疫吸附实验(间接ELISA法)检测血液和唾液中IgG和S-IgA抗体水平。 结果：①使用试剂盒抽提出符合实验要求的重组质粒pVAXl-spap/A, pVAX1-gtfB/CAT、pVAX1-spap/A-gtfB/CAT及空载体质粒pVAX1。②生物降解水凝胶P(CL-GA)-PEG-P(CL-GA)在37℃发生溶液相-凝胶相转变。重组质粒pVAX1-spap/A、pVAX1-gtfB/CAT、pVAX1-spap/A-gtfB/CAT能够在水凝胶P(CL-GA)-PEG-P(CL-GA)为缓释系统的体系中缓慢释放。③以生物降解水凝胶P(CL-GA)-PEG-P(CL-GA)为载体的重组质粒pVAX1-spap/A、pVAX1-gtfB/CAT、pVAX1-spap/A-gtfB/CAT缓释系统在免疫SD大鼠后,可以诱导S-IgA型特异性抗体和IgG型特异性抗体均明显升高,并持续数周。④实验组与对照组相比,龋损明显降低,具有统计学意义(P0.05)。 结论：①本实验证明温敏型生物降解水凝胶P(CL-GA)-PEG-P(CL-GA)具有温度敏感性,在37℃时发生溶液相—凝胶相的转变；②防龋基因疫苗pVAX1-spap/A、pVAX1-gtfB/CAT和pVAX1-spap/A-gtfB/CAT在水凝胶作为缓释系统的条件下,可以有效地减缓质粒DNA的释放,起到缓释作用；③防龋基因疫苗pVAX1-spap/A、pVAX1-gtfB/CAT、pVAXl-spap/A-gtfB/CAT在水凝胶作为缓释系统的条件下,能诱导SD大鼠的血液和唾液中特异性抗体的产生,抑制大鼠龋齿的发生。
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图片说明： 3.2.2重组质粒pvAxl一gt扭/cAT双酶切鉴定重组质粒pVAXI一gt侣/CAT经柳nI/Eco川双酶切为 3.okb和500bp的两个月‘段(见图1一2)。片段 500bp与 gtm/CAT基因片段大小相同。图1一2玉纤{质粒pVAx卜gtfB/CAT的酶切鉴定Fig.l一 2ThemaPofthereeombinantPlasmidPVAXI一gtfB/CAI， wasldelltified1:KPlll/Ec0RI双酶切后的pV入xl一gtfB/cATMI:DL一 2000MarkerMZ:补 EeoT141digestMarker 3.2.3重组质粒pvAxl一sPaP/A一gt扭/CAT双酶切鉴定币全!1一质粒pVAXI一spap/A一gt侣/CAT经Kpnl/EeoRI双酶切为3.Okb不 !}1.skb的I月J个片段见(l冬11一3)。片段1.skb’、spap/A一gt伯/cAT从因片段人小相同。
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本文编号：2514045