诱导人眼轮匝肌来源肌源干细胞分化为类雪旺细胞的研究

发布时间：2019-07-14 21:16

【摘要】：【研究背景】周围神经缺损后移植修复常以牺牲供区神经为代价,以雪旺细胞为基础的组织工程神经研究为周围神经损伤的修复带来新选择,却同样不可避免损伤另一条神经。避开胚胎干细胞的伦理学障碍,诱导成体干细胞分化为类雪旺细胞(Schwann cell-like cell lineages,SCs-like)进行组织工程神经研究,正受到广泛关注。肌源性干细胞(muscle-derived stem cells,MDSCs)是一类新近发现的成体干细胞,具有干细胞的一般特性。肌源性干细胞多系统分化潜能表现为经诱导可分化为骨、软骨细胞、血管内皮细胞、造血干细胞、脂肪细胞等,自我更新能力表现为经过30次传代培养后能保持初始的细胞表型及基因组构成。具有移植免疫优越性是肌源性干细胞的独特优势。肌源性干细胞日益被应用到骨骼、肌肉等组织的再生医学研究中,已有动物体内实验研究表明MDSCs能促进肌纤维的再生、增强再生肌组织的功能,并能少量分化为神经外膜组织和具有雪旺细胞(Schwann cells,SCs)表型的细胞。后者为组织工程神经研究寻找新的类雪旺细胞作为种子细胞带来可能。近年人源肌源干细胞(human muscle-derived stem cells,h-MDSCs)的成功分离拉近了肌源干细胞与再生医学临床应用之间的距离。【目的】(1)掌握显微镜下小鼠肌组织分离和肌源干细胞分离过程中三重酶消化和细胞筛过滤方法,应用改良的差速贴壁法从小鼠肌组织分离得到肌源干细胞,应用有限稀释技术培养肌源干细胞单细胞克隆和亚克隆集落;(2)从重睑成形术废弃的组织中寻找可供利用的健康肌组织,并分析其作为科学研究用途的合理性;(3)借鉴小鼠肌源干细胞分离方法,建立从人眼轮匝肌组织分离人源肌源干细胞的方法,为人成体干细胞的研究提供新的组织分离来源,并分析其获取方法从“微创”到“无创”的进步;(4)从大鼠坐骨神经获取雪旺细胞进行原代和传代培养,制备雪旺细胞条件培养液;(5)将人源肌源干细胞与雪旺细胞条件培液共培养,诱导人源肌源干细胞向雪旺细胞方向分化,为组织工程神经研究寻找可能的种子细胞替代物。【方法】(1)显微镜下依次剥离骨、软骨和神经血管组织,获得较为单一的小鼠肌组织;经过胶原酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶三重消化,继以100目、200目和400目细胞筛过滤,得到富含肌源干细胞的细胞悬液;通过改良差速贴壁法的首次贴壁时间为1小时,分离和培养小鼠肌源干细胞,相差显微镜下观察历次贴壁细胞和肌源干细胞的细胞形态和生长状态;通过有限稀释技术培养肌源干细胞单细胞克隆和亚克隆集落,描绘细胞克隆生长曲线;应用免疫组织化学染色法标记肌源干细胞表面Desmin和Sca-1,鉴定其细胞来源和表面干细胞特异标记物;(2)2010年7月至2010年11月间,选择三名行重睑成形术的女性患者作为志愿者(年龄19-24周岁)。志愿者在第二军医大学长征医院整形外科接受切开法重睑成形术后,收集志愿者提供的眼轮匝肌,进行数据测量并转移至实验室。通过与获取人体健康组织的常见方法比较,分析重睑成形术中获取眼轮匝肌作为研究对象的合理性;(3)借鉴小鼠肌源干细胞分离方法,镜下依次去除附着于肌组织的筋膜组织和神经血管组织,获得较为单一的眼轮匝肌组织;经胶原酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶三重消化,继以100目、200目和400目细胞筛过滤,得到富含人源肌源干细胞的细胞悬液;通过差速贴壁去除成纤维细胞,分离和培养人源肌源干细胞,相差显微镜下观察人源肌源干细胞的细胞形态和生长状态;应用免疫组织化学染色法鉴定人源肌源干细胞表面Desmin和Sca-1,鉴定其细胞来源和表面干细胞特异标记物;通过与人成体干细胞常见分离方法的比较,分析该方法“无创”的优越性;(4)获取新生大鼠坐骨神经,显微镜下去除神经外膜,胰蛋白酶消化后,进行雪旺细胞的的原代和传代细胞培养,通过免疫组织化学染色法鉴定雪旺细胞并分析细胞纯度;通过半量换液,收集雪旺细胞条件培液;(5)通过与雪旺细胞条件培液共培养,诱导人源肌源干细胞向雪旺细胞方向分化,相差显微镜下观察细胞形态,免疫组织化学染色法标记诱导分化后细胞表面的雪旺细胞特异标记物S100,GFAP和p75。【结果】(1)通过应用改良的差速贴壁法和有限稀释技术,从小鼠肌组织成功分离培养出肌源干细胞,光镜下观察细胞呈现典型的短梭形和小圆形形态特征,呈现集落样生长,增殖速度快,未发生分化。免疫组织化学染色显示细胞均呈现Desmin阳性染色,Sca-1阳性染色,Sca-1阳性率为92.3±4.1%;(2)收集三名接受重睑成形术的患者志愿提供的双侧上睑眼轮匝肌共6条,双侧眼轮匝肌湿重合计156-241mg之间,达到分离细胞所需的组织量;(3)从眼轮匝肌中分离和培养人源肌源干细胞,光镜下观察细胞呈现典型的短梭形和小圆形形态特征,增殖速度快,未发生分化。免疫组织化学染色显示细胞均呈现Desmin阳性染色,Sca-1阳性染色,Sca-1阳性率为81.8±2.4%;(4)成功分离大鼠坐骨神经来源的雪旺细胞,进行细胞原代和传代培养,免疫组织化学染色法标记雪旺细胞表面S100蛋白,显示S100染色阳性,阳性率为97.4±0.7%;通过半量换液,制备雪旺细胞条件培液;(5)成功诱导人源肌源干细胞向雪旺细胞方向分化,免疫组织化学染色法标记分化后类雪旺细胞表面特异标记物S100,GFAP和p75,染色结果显示阳性,阳性率分别为65.1±3.4%,23.3±1.7%和30.3±5.2%。【结论】(1)应用改良的差速贴壁法,可从小鼠肌组织中分离得到肌源干细胞;(2)借鉴小鼠肌源干细胞的分离培养方法,可从人眼轮匝肌分离得到人源肌源干细胞,增加了肌源干细胞的分离来源,为人源成体干细胞的研究提供了新的细胞来源;(3)应用雪旺细胞条件培液可诱导人源肌源干细胞分化为类雪旺细胞,为组织工程神经研究寻找到新的种子细胞替代物;(4)诸如重睑成形术等美容整形手术可为组织工程和再生医学的基础研究和潜在临床应用提供更为合理的人体健康组织和成体干细胞来源。
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图片说明：第二军医大学博士学位论文图1-1 相差显微镜下MDSCs分离过程中贴壁的pp1-pp5细胞贴壁细胞生长一周时形态记录。图A，B，C 为 pp1 贴壁生长一周后不同倍数下的形态记录，依次至图 M，N，O 为 pp5。pp1 约半数以上细胞为不规则的成纤维细胞和上皮细胞（图 A），一周时成熟肌细胞结构破坏，可见明显增大的细胞核（图 C），pp2、pp3 和 pp4 除少量细胞外均为肌性来源
文内图片：相差显微镜下培养2周的MDSCs、MDSC单克隆和MDSCs亚克隆生长状态和细胞形态特征

图片说明：图 1-4 相差显微镜下培养 2 周的 MDSCs、MDSC 单克隆和 MDSCs 亚克隆生长状态和细胞形态特征。图 A 示两个相邻 MDSCs 集落，集落之间分界明显；图 D 和图 G 分别为 MDSC 单细胞克隆集落和亚克隆集落。图 F，I 示 MDSC 克隆集落细胞多数呈小圆形，折光性强，少量呈短梭形，未出现向成熟肌细胞分化的状态。(A，D，G；bar=200um；B，E，H；bar=100um；C，F，I；bar=50um.)图 1-5 MDSC 单克隆细胞 Desmin/Sca-1 免疫组织化学染色。MDSC 单克隆细胞均呈现 Desmin 染色阳性（绿色，图 A），Sca-1 染色阳性（红色，图 B），Sca-1 阳性率为 92.3±4.1%；图 C 示 Desmin/Sca-1共标。阴性对照组无阳性标记。(A，B，C； bar=33um)26
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R329

【共引文献】