EV71济南分离株感染性克隆的构建及其生物学特征分析

发布时间：2019-07-14 18:47

【摘要】：目的构建以济南本土分离株为模板的EV71感染性克隆,转染细胞以获得拯救病毒并观察其生物学特性,为研究EV71病毒基因结构和功能奠定基础。方法分段扩增EV71基因组cDNA并顺序连接至pCDNA3.1载体,同时在序列两端引入自剪切核酶序列,构建能直接转染细胞的病毒基因组全长cDNA克隆,转染RD细胞后获得拯救病毒。通过噬斑形成试验、间接免疫荧光试验和感染性滴度测定观察拯救病毒的生物学特征。结果成功构建了病毒基因组全长cDNA克隆,转染RD细胞后观察到典型细胞病变,收获的病毒经RT-PCR扩增出特异性目的片段,全序列测定结果表明拯救病毒与父本株相比具有3个同义突变,未导致推导氨基酸的变异;拯救的子代病毒感染RD细胞后形成典型的空斑;间接免疫荧光试验检测拯救病毒感染细胞可见特异性荧光,荧光密度较父本株病毒稍弱;拯救病毒传代稳定,其感染性滴度(10-3.48)较父本株(10-5.0)稍低。结论成功构建了真核载体的病毒全长cDNA感染性克隆,拯救病毒与野生株具有相似的生物学性状和感染性。
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图片说明： 目的基因序列与ＪＮ２００８０４株完全相同，５＇端和３＇端成功引入限制性酶切位点和核酶序列，同时３＇端成功引入２５个Ａ的ｐｏｌｙ（Ａ）尾巴。２细胞转染克隆质粒转染ＲＤ细胞后７２ｈ，可见到典型的ＣＰＥ。ＣＰＥ逐日增多，５ｄ后将转染细胞培养上清以２０％比例传代，，第３ｄ病变达到７５％以上（图１－Ｂ）。对照细胞培养３ｄ时均仍保持正常形态（图１－Ａ）。Ａ正常对照细胞（３ｄ）ＢｃＤＮＡ克隆转染ＲＤ细胞（３ｄ）图１ｃＤＮＡ克隆转染ＲＤ细胞病变（１００×）ＡＣｏｎｔｒｏｌｃｅｌｌｓＢＣｅｌｌｓｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈＦｕｌｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡＦｉｇ．１ＣｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｅｆｆｅｃｔｏｎＲＤｃｅｌｌｓ（１００×）３拯救病毒鉴定采用ＥＶ７１特异性国家标准引物对拯救病毒感染细胞ＲＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ，得到约２２６ｂｐ的扩增片段，大小与预期一致（图２）。将拯救子代病毒进行全序列测定，并与ＪＮ２００８０４株进行全序列比对，发现有３个碱基发生变异，分别位于４３８６、５１８４和７１６７ｂｐ，均为同义突变，未导致推导氨基酸的变异。１拯救病毒ＲＴ－ＰＣＲ产物ＭＤＮＡ标志物图２拯救病毒ＲＴ－ＰＣＲ鉴定１ＲＴ－ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｒｅｓｃｕｅｄｖｉｒｕｓＭＤＮＡＭａｒｋｅｒＦｉｇ．２Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｓｃｕｅｄｖｉｒｕｓ４噬斑形成试验拯救的子代病毒和ＪＮ２００８０４株感染ＲＤ细胞后均可形成明显的空斑，其形态典型，大小均一。但子代病毒与父本株相
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图片说明： 时均仍保持正常形态（图１－Ａ）。Ａ正常对照细胞（３ｄ）ＢｃＤＮＡ克隆转染ＲＤ细胞（３ｄ）图１ｃＤＮＡ克隆转染ＲＤ细胞病变（１００×）ＡＣｏｎｔｒｏｌｃｅｌｌｓＢＣｅｌｌｓｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈＦｕｌｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡＦｉｇ．１ＣｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｅｆｆｅｃｔｏｎＲＤｃｅｌｌｓ（１００×）３拯救病毒鉴定采用ＥＶ７１特异性国家标准引物对拯救病毒感染细胞ＲＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ，得到约２２６ｂｐ的扩增片段，大小与预期一致（图２）。将拯救子代病毒进行全序列测定，并与ＪＮ２００８０４株进行全序列比对，发现有３个碱基发生变异，分别位于４３８６、５１８４和７１６７ｂｐ，均为同义突变，未导致推导氨基酸的变异。１拯救病毒ＲＴ－ＰＣＲ产物ＭＤＮＡ标志物图２拯救病毒ＲＴ－ＰＣＲ鉴定１ＲＴ－ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｒｅｓｃｕｅｄｖｉｒｕｓＭＤＮＡＭａｒｋｅｒＦｉｇ．２Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｓｃｕｅｄｖｉｒｕｓ４噬斑形成试验拯救的子代病毒和ＪＮ２００８０４株感染ＲＤ细胞后均可形成明显的空斑，其形态典型，大小均一。但子代病毒与父本株相比噬斑边缘较圆滑，平均直径稍小（图３）。５间接免疫荧光试验拯救病毒传代后以ＥＶ７１单克隆抗体为一抗，荧光素标记羊抗鼠ＩｇＧ为二抗进行间接免疫荧光试验，可见到特异性荧光，荧光密度较ＪＮ２００８０４株病毒稍弱（图４－Ｃ）。ＪＮ２００８０４株病毒感染细胞可见荧光，而细胞对照无荧光产生（图４－Ｂ、Ａ）。表明拯救子代病毒具有感染性。６病毒感染性滴
【作者单位】： 山东省医学科学院基础医学研究所山东省罕少见病重点实验室;
【基金】：国家自然科学基金青年基金项目(No.31500050) 山东省自然科学基金青年基金项目(No.ZR2013HQ039) 山东省医药卫生科技发展计划项目(No.2015WS0195) 山东省医科院院级课题面上项目(No.2015-27)
【分类号】：R373

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本文编号：2514444