1、三种不同方法所提取的B群脑膜炎球菌外膜囊泡组分及其免疫原性研究 2、B群脑膜炎球菌lpxL2基因敲除突变株的构建及初

发布时间：2019-07-14 18:27

【摘要】：目的：用三种不同的方法提取B群脑膜炎奈瑟氏菌的外膜囊泡,分别为dOMV、nOMV、sOMV,并比较分析其免疫原性和毒性,为B群脑膜炎OMV疫苗的研究提供了一定的实验依据。方法：用超速离心的方法获得三种OMV,通过SDS-PAGE实验分析其主要蛋白组分,Lowry法测定各种OMV的蛋白含量,LAL实验测定其内毒素含量。免疫小鼠,通过ELISA实验测定小鼠血清中的IgG含量,证实其免疫原性,杀菌力实验测试三种OMV诱导针对B群脑膜炎奈瑟氏菌补体依赖的杀菌反应。结果：SDS-PAGE实验结果显示三种外膜的主要蛋白成分基本一致。LAL实验证实sOMV的内毒素含量最多,其次为nOMV, dOMV含量最少。免疫小鼠后,ELISA和杀菌力实验证实nOMV的免疫效果最好,其次为dOMV, sOMV免疫效果较差。结论：用三种不同的方法成功制备了B群脑膜炎奈瑟氏菌的外膜囊泡(dOMV、nOMV、sOMV),从免疫原性、毒性等方面对三种外膜囊做了评价和比较,为制备B群脑膜炎OMV疫苗的相关研究做了铺垫。脑膜炎球菌天然外膜微泡(nOMV)包含完整的外膜,其中的外膜蛋白(OMP)和脂寡糖(LOS)处于自然构象和天然外膜环境,有很好的免疫原性,但是其LOS毒性限制其应用。基因1pxL2编码与LOS脂质A合成相关的酶,1pxL2基因敲除后可以降低LOS毒性,并且可能会提高疫苗对表面活性剂的敏感度。在本研究中,应用基因敲除技术的方法和原理,通过PCR扩增B群脑膜炎球菌1pxL2基因及载体pGBK T7上的Kan抗性片段,1pxL2片段与puc-18载体连接得到重组质粒msb-puc,以重组质粒msb-puc为基础,分别通过反向PCR和酶切两种方法构建1pxL2基因中间片段的缺失,并在缺失位点连入Kan抗性表达盒,从而得到重组质粒mpK(impK), mpK(impK)转化B群脑膜炎球菌,并用PCR的方法对转化子进行初步筛选鉴定,初步确定突变株一株。本研究通过基因敲除MenB中LOS合成途径相关基因1pxL2的方法,降低LOS毒性,为B群脑膜炎球菌OMV疫苗的研发做了铺垫。
文内图片：三种疫苗的0卿产率

图片说明：中国医学科学院中国协和医科大学硕士研究生毕业论文用去污剂处理的提取过程，PorA、PorB所占百分比较高(4.316%、2.216%);未经去污剂处理的提取过程，OPaproteins所占百分比较高(noMV9.163%，soMV7.047%);三种不同的提取过程，RmpM所占百分比差异不大。2.OMV产率以总蛋白产率比推算OMV产率(图1.2)。用去污剂处理所得的dOMV的产率最高(H.64)，未用去污剂处理，仅用EDTA刺激菌体释放OMV的nOMV产率仅次于dOMV(10.21)，未用去污剂及ED工A所提取的s0MV的产率最低(4.135)。
文内图片：

图片说明： (1)以重组质粒msb一puc为模板的反向PCR①反向PCR的引物设计与合成根据根据GenBallk核酸数据库中Nm基因组msbB序列，用Prime卜BLAST设计引物，引物设计位点如图2.1所示。上下游引物引入酶切位点Bgln，序列如下:msbB一52:5”一GAAGAI，CTGAGGAACGCGTGCGCGAACAI，，一3’ Bgl11msbB一AZ:5”一GAAGAI，CTAAGCGCGTACACCGCCAI，CTC一3’ Bgl11
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392.1

【参考文献】