b型流感嗜血杆菌结合疫苗结合及冻干制备工艺相关研究

发布时间：2017-03-16 08:04

  本文关键词：b型流感嗜血杆菌结合疫苗结合及冻干制备工艺相关研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)是引起小儿细菌性脑膜炎和急性呼吸道传染病的主要致病菌,预防该疾病的有效方法是接种Hib结合疫苗。目前市场上尚无经CDAP活化多糖,借助ADH与载体蛋白结合制备而成的Hib结合疫苗。Hib结合冻干疫苗现今在国内也还未有厂家生产上市,其冻干剂型的研究具有重要的现实和发展意义。第一部分：b型流感嗜血杆菌多糖结合物原液制备工艺的研究本研究采用CDAP法活化符合要求的精制荚膜多糖抗原,通过乙二酰肼(ADH)与破伤风类毒素蛋白(TT)共价结合,制备Hib荚膜多糖与TT的结合物原液,结合物原液经过Sepharose 4FF凝胶层析柱纯化出多糖蛋白结合物。本实验运用响应面设计和正交分析法对Hib荚膜多糖的活化和结合过程中部分关键因素进行优化。结果显示,优化后多糖与蛋白的结合率显著增加,对优化后的结合物原液中多糖、高分子结合物、免疫原性等指标进行检测,各项指标均符合WHO要求。第二部分：Hib结合疫苗冻干剂型的研究及其多糖含量的ELISA检测本实验采用乳糖、海藻糖、右旋糖酐-40、甘露醇作为冻干保护剂对Hib冻干疫苗的制备进行探究。结果显示,当使用适当浓度的右旋糖酐-40和乳糖作为共同冻干保护剂时,所得冻干制品外形及保护效果最好。对冻干制品的高分子结合物、分子量、免疫原性等各项指标进行检测,其各指标均符合WHO要求。Hib冻干剂型的研制不仅有利于增加疫苗保存时间,便于疫苗运输,更为DTaP-sIPV-Hib等联合疫苗的研究奠定了基础。本实验同时建立了一种竞争法ELISA对Hib多糖抗原进行定量检测,该法精确度、灵敏度,稳定性等指标均较好。Hib多糖ELISA检测方法的建立能够弥补传统化学法灵敏度低,受杂质干扰大的缺点,对提高多糖产量,降低Hib疫苗生产成本具有深远意义。
【关键词】：b型流感嗜血杆菌 荚膜多糖 结合疫苗 冻干剂型 竞争法ELISA
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要7-8
• Abstract8-10
• 缩略语10-11
• 第一部分：b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗制备工艺的研究11-54
• 引言11-13
• 1 材料13-15
• 1.1 菌株来源13
• 1.2 主要试剂13-14
• 1.3 主要器材与仪器14-15
• 1.4 主要试剂配方见附录215
• 2 方法15-33
• 2.1 菌种名称及来源15
• 2.2 细菌发酵15-16
• 2.2.1 菌株复苏15
• 2.2.2 菌种鉴定15-16
• 2.2.3 Hib菌种的发酵培养16
• 2.3 多糖制备工艺16-18
• 2.3.1 沉淀复合糖16-17
• 2.3.2 去核酸17
• 2.3.3 制备粗糖17
• 2.3.4 苯酚抽提去除蛋白17
• 2.3.5 超滤17
• 2.3.6 制备精糖17-18
• 2.4 Hib多糖的衍化18-21
• 2.4.1 衍化过程的Box-behnken实验设计18
• 2.4.2 Hib荚膜多糖衍生物的制备18-20
• 2.4.3 PRP多糖衍化率与结合率的关系探究20
• 2.4.4 Hib荚膜多糖-TT蛋白结合物的纯化20
• 2.4.5 衍化率与结合率关系的重复性实验验证20-21
• 2.5 Hib-TT结合过程的优化21-23
• 2.5.1 Hib多糖衍生物与TT结合实验的正交设计21
• 2.5.2 多糖衍生物的制备21
• 2.5.3 结合物原液的制备21-22
• 2.5.4 结合物的纯化22
• 2.5.5 最高结合率的重复性实验验证22-23
• 2.6 检测23-33
• 2.6.1 Hib多糖各项指标检测23-25
• 2.6.2 Hib多糖衍生物与结合物相关检测25-33
• 3 结果33-51
• 3.1 Hib多糖质量鉴定33-35
• 3.1.1 镜检33
• 3.1.2 Hib多糖~1H-NMR谱33-34
• 3.1.3 Hib多糖相关指标检测34-35
• 3.2 Hib结合相关检测结果35-51
• 3.2.1 响应面分析法优化Hib多糖的衍化35-44
• 3.2.2 正交试验优化Hib与TT结合的实验结果44-51
• 4 讨论51-54
• 第二部分 b型流感嗜血杆菌结合疫苗的冻干及其多糖ELISA方法的定量检测54-75
• 引言54-56
• 1 材料56-57
• 1.1 主要材料56
• 1.2 主要试剂56-57
• 1.3 主要器材与仪器57
• 1.4 主要试剂配方见附录257
• 2 方法57-61
• 2.1 Hib冻干剂型的研究57-58
• 2.1.1 冻干保护剂的配制57
• 2.1.2 Hib结合物原液处理57-58
• 2.1.3 冻干原液的配制及分装58
• 2.1.4 冻干58
• 2.1.5 冻干剂型的再研究58
• 2.1.6 冻干剂型的重复性实验验证58
• 2.2 Hib多糖间接竞争ELISA检测方法的建立58-60
• 2.2.1 包被多糖抗原及多糖抗血清浓度的确定58-59
• 2.2.2 标准曲线的建立及最低检测线的确定59
• 2.2.3 精确度的确定59
• 2.2.4 批间精密度的确定59
• 2.2.5 方法应用59-60
• 2.3 冻干剂型检测60-61
• 2.3.1 鉴别实验60
• 2.3.2 高分子含量检测60
• 2.3.3 多糖含量检测60
• 2.3.4 成形率计算60
• 2.3.5 内毒素含量检测60
• 2.3.6 分子量大小检测60-61
• 2.3.7 无菌试验检测61
• 2.3.8 效力实验61
• 3 结果61-72
• 3.1 Hib冻干结合疫苗相关结果61-68
• 3.1.1 乳糖作为保护剂时相关指标检测61-62
• 3.1.2 海藻糖作为保护剂时相关指标检测62
• 3.1.3 右旋糖酐-40作为保护剂时相关指标检测62-63
• 3.1.4 甘露醇作为保护剂时相关指标检测63-64
• 3.1.5 两种保护剂共同作用下Hib冻干结合疫苗相关检测64
• 3.1.6 混合保护剂下重复性实验验证64-65
• 3.1.7 部分Hib冻干剂型外观65
• 3.1.8 冻干剂型分子量大小的测定65-66
• 3.1.9 免疫双扩检测66-67
• 3.1.10 无菌试验检测67
• 3.1.11 内毒素含量测定67
• 3.1.12 效力试验67-68
• 3.2 Hib多糖ELISA检测方法的建立68-72
• 3.2.1 最适PRP-Ty包被浓度和最适Hib抗血清稀释倍数68
• 3.2.2 标准曲线及最低检测线68-69
• 3.2.3 间接竞争ELISA法准确性和批内精密度检测69-70
• 3.2.4 批间精密度及其与传统化学法检测的比较70-71
• 3.2.5 间接竞争ELISA法的应用71-72
• 4 讨论72-75
• 总结和展望75-76
• 1 总结75
• 2 展望75-76
• 参考文献76-80
• 综述80-89
• 参考文献86-89
• 附录2 溶液配制89-96
• 攻读硕士学位期间以第一作者发表的文章96
• 个人简历96-97
• 致谢97

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 蒲丽丽,刘宁,张英华,霍贵成;乳酸菌冻干保护剂及保护机理的研究进展[J];现代食品科技;2005年01期

2 胡莹;夏晓玲;黄海林;单斌;李丰良;黄云昆;刘晓莉;;昆明地区儿童下呼吸道感染流感嗜血杆菌分离株的耐药性和血清分型研究[J];实验与检验医学;2013年02期

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本文编号：251484