纤维堆囊菌So0157-2埃博霉素合成相关调控蛋白的分离和鉴定

发布时间：2019-07-16 08:40

【摘要】：粘细菌纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)是抗肿瘤药物埃博霉素的产生菌,埃博霉素具有和紫杉醇类似的抗肿瘤活性,并且具有分子量小、结构简单,水溶性好,毒副作用小,不易诱发耐药性等诸多优于紫杉醇的优点,尤其对紫杉醇类耐药的肿瘤细胞具有较高活性,使其具有巨大的药用价值。但其合成技术上的瓶颈严重制约了该类药物的研发；遗传操作手段的缺乏,则进一步限制了埃博霉素生物合成调控及遗传改造的研究。为了从根本上了解埃博霉素的调控机制,提高埃博霉素的产量,我们进行了纤维堆囊菌So0157-2埃博霉素合成相关的调控蛋白进行了分离和鉴定。我们通过生物素同链霉亲和素相互作用的磁珠,利用埃博霉素合成基因簇上游的非编码区对不同培养条件下的So0157-2埃博霉素调控蛋白进行钓取。选择埃博霉素产量有明显差异的合成培养基和M26培养基对埃博霉素调控蛋白进行DNA pull-down实验。为了获得尽可能多的调控因子,选择埃博霉素合成基因簇与上游可预测的编码基因之间的1332bp的序列作为pull-down的诱饵。获得的两种培养条件下的蛋白进行SDS-PAGE分惜,将合成培养条件下和M26培养条件下的差异蛋白进行shot-gun质谱检测。检测结果同So ce56数据库比对获得16个转录调控因子,同So0157-2数据库比对获得5个So0157-2特有的调控因子,经过生物信息学分析后从中选择了三个蛋白命名为Etf1、Etf2、Etf3。分别对Etf1、Etf2、Etf3构建表达载体,异源表达并纯化获得Etf1、Etf2、Etf3纯蛋白,利用EMSA对这三个货白进行体外结合活性的验证。纤维堆囊菌So0157-2的遗传操作体系尚不完善造成了我们对于转录调控因子体内调控作用进行深入探索的困难,因此我们将调控序列和调控蛋白分别克隆到两个质粒上。其中So0157-2埃博霉素合成基因簇上游调控序列USE(upstream sequence of epothilone biosynthetic gene clusters,1332bp)、CUSE(conserved USE,425bp)、PUSE(putative USE,158bp)连上绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因后克隆入pET-28a载体中,新构建的质粒分别编号为pWLUSE01、pWLUSE02、 pWLUSE03;将调控蛋白Etfl、Etf2和Etf3基因克隆入pBAD33,置于阿拉伯糖启动子下,分别编号为pWLETFO、pWLETF02、pWLETF03。将构建好的质粒共转化到Ecoli Top1OF感受态细胞中。 Etfl能同埃博霉素合成基因簇上游调控序列1332bp全长USE (upstream sequence of epothilone biosynthetic gene clusters)、CUSE (conserved USE)结合形成清晰的阻滞条带,证实Etfl可以和USE、CUSE结合,在加入了非特异竞争性DNA PolydIdC后仍然有阻滞现象,证实Etf1的结合是特异的,并且Etfl的结合受盐离子浓度的影响不大,Etf2、Etf3的结合微弱阻滞现象不明显。为了进一步验证转录因子在体内的调控作用,我们建立了异源体内结合体系,以Etf1为例进行了验证。首先采用RT-PCR方法对Etfl的表达进行了转录分析,验证Etfl基因的转录,接着采用Westernblot证实了Etf1的表达。利用分光光度计对pWLETF0l同pWLUSEO1、pWLUSE02、pWLUSE03共转化的菌休在诱导和未诱导条件下的荧光信号进行检测,结果显示pWLETF01同pWLUSE01, pWLUSE02共转化的菌体在未诱导和未诱导条件下均能检测到荧光信号。前者荧光强度随培养时间的增加而增强；后者在添加了诱导剂阿拉伯糖后,荧光强度就不再随时间的增加而增强。pWLETF01同pWLUSE03共转化的菌体在诱导和未诱导条件下均未检测到荧光信号,由此此可知埃博霉素合成基因簇上游调控序列USE、CUSE可以被大肠杆菌的转录系统识别并启动下游报告基因EGFP的转录,而PUSE不能被其识别。Etfl作为负调控因子同USE01、USE02结合而阻遏下游报告基因EGFP的表达。同时也证明我们的异源结合体系是可行的。利用异源体内结合体系对另外两个蛋白Etf2、Etf3进行验证,结果荧光信号并没有变化,由于EMSA的结果显示Etf2、Etf3在体外DNA结合活性较弱,说明Etf2、Etf3在体内的DNA结合也相对较弱。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R378

【参考文献】