EGF诱导的Src信号动力学的实时光学成像研究

发布时间：2019-07-17 08:19

【摘要】：蛋白质酪氨酸磷酸化对诸多基本细胞过程起着关键的调控作用，包括细胞生长、粘附、增殖等。因为蛋白质酪氨酸激酶（Protein Tyrosine Kinases, PTKs）与蛋白质酪氨酸磷脂酶（Protein Tyrosine Phosphatases, PTPs）的相互拮抗，所以一个特定蛋白质的酪氨酸磷酸化水平是PTKs和PTPs共同作用的结果。最近研究发现酪氨酸磷酸化过程受双氧水(Hydrogen Peroxide, H_2O_2)介导的氧化还原过程调节。证据显示H_2O_2可以通过氧化PTPs活性中心的半胱氨酸残基而抑制其活性。目前逐渐形成有关H_2O_2在生长因子诱导的酪氨酸磷酸化信号中的作用的假说：PTKs的激活不足以提高蛋白质的酪氨酸磷酸化稳态水平，同时也需要内源性H_2O_2介导的PTPs抑制作用的参与。虽然H_2O_2参与酪氨酸磷酸化信号通路的分子机制已经被广为接受，但是H_2O_2是以何种方式调节酪氨酸磷酸化信号动力学过程及其特点仍不清楚，尤其是缺乏活细胞内的实时动态调节信息；此外，在外源性H_2O_2诱导的氧化应激中，细胞内谷胱甘肽（Glutathione, GSH）氧化还原电势与酪氨酸磷酸化动力学之间的关系至今未见报道。 本研究使用基于荧光蛋白的荧光能量共振转移（Fluorescence Resonance EnergyTransfer, FRET）探针Src探针在活细胞水平对上表皮生长因子（Epidermal GrowthFactor, EGF）诱导的和Src激酶介导的酪氨酸磷酸化过程（简称Src信号）进行了定量研究，发现内源性H_2O_2通过抑制PTPs活性，正向地调节Src信号的峰值强度和持续时间。为了在单个细胞内对Src信号动力学与外源性H_2O_2诱导的细胞GSH氧化还原电势变化动力学进行同步研究，，我们发展了基于mVenus/mKOκ FRET对的Src探针和基于单个荧光蛋白的Grx1-roGFP2探针的双分子成像方法，在单个细胞中，实现了Src信号和氧化还原电势信号动力学变化的实时同步成像。研究显示，在外源性H_2O_2诱导下，细胞内GSH氧化还原体系参与负调节EGF诱导的Src信号。 主要研究结果如下： 1）活细胞内，在EGF刺激下，利用Src光学探针，我们得到了Src信号动力学。 结果显示Src信号动力学曲线与用生化方法得到的EGF诱导的细胞外信号调节激酶（Extracellular signal-regulated kinase, ERK）信号动力学曲线类似，通过借鉴用来描述ERK动力学的数学模型和参数，我们引入三个简化的参数来定量描述Src信号动力学：信号峰值、信号持续时间和积分信号强度。并建立了这三个参数与Src活化程度和PTPs活性之间的关联。 2）在活细胞内，发现内源性H_2O_2通过抑制PTPs活性来调节Src的信号峰值和持续时间。通过细胞内表达H_2O_2相关调节基因Rac1-N17和Prx1-Y197F，降低内源H_2O_2水平，结果显示Src的信号峰值和持续时间均大大降低。而PTPs特异抑制剂vanadate能够消除此影响。 3）结果提示EGF诱导的内源性H_2O_2必须局部产生，这样可以避免触发细胞抗氧化防御机制。动力学数据显示这个防御机制不利于Src介导的酪氨酸磷酸化信号。 4）发展了基于黄色荧光蛋白mVenus和橙色荧光蛋白mKOκ的新FRET对，建立了基于mVenus/mKOκ (简称YO) FRET对和单荧光蛋白探针Grx1-roGFP2的双比率实时同步成像新方法。实验结果显示，在进行多色荧光信号双比率实时成像时，无需特殊的算法处理，即可获得双生物分子信号互不干扰的动态信息。 5）设计了基于YO FRET对的Src激酶探针：YO-Src。在单细胞内，对YO-Src和Grx1-roGFP2探针进行同步成像，结果显示，外源H_2O_2对EGF诱导的Src信号起负向调节作用。 本论文，以可视化、定量化的实验方法，在活细胞水平，显示了EGF诱导的Src信号动力学。阐明了内源性和外源性H_2O_2在Src信号动力学中的作用特点，同时增进了对信号分子H_2O_2在细胞中重要作用的理解。本论文建立的荧光信号定量表征分子事件的研究方法，也适用于其它信号途径中分子事件的研究；建立的双比率成像方法，可以广泛地应用到细胞信号转导途径双分子事件时空特性描述中。
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图片说明： 3图 1.1 PTKs 和 PTPs 家族[1]。（A）PTKs 通常可以分为膜受体和细胞质激酶两类，分别为 RTKs和 cPTKs。（B）PTPs 家族可以分为酪氨酸特异性和双特异性两类。酪氨酸特异性酯酶又可进一步分为受体样和细胞质酯酶两种，分别为 RPTPs 和 cPTPs。
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图片说明： Src 激酶有着复杂而精细的结构（图 1.2），用来调节自身酶活性[9]。 Src 在 N端有一个特殊的区域，包含有豆蔻酰化位点，影响亚细胞定位；SH3 结构域，能特异地与富含脯氨酸的基序结合介导分子内或是分子间的相互作用； SH2 结构域，能特异地结合在磷酸化的酪氨酸位点基序；一个连接结构域，参与结合分子内 SH3结构域；负责催化反应的激酶结构域（又称 SH1 结构域），这个结构域包括一个控制与底物结合的 activation loop（A-loop），和一个自催化位点 Tyr416，此位点的磷酸化使得激酶处于最大活性状态；C 端的尾巴多肽，包括一个 Tyr527，此位点的磷酸化后，与 SH2 结构域结合，使得 Src 激酶处于失活的状态。由于 Src 激酶在细胞中的重要性，所以 Src 的活性受到了严密的调控。而 Src复杂的调节机制使得 Src 能处于不同的活性水平[10]。一个是完全失活形式，这个形式特点是 SH3/SH2 的相互作用、磷酸化的 Tyr527 和非磷酸化状态的 A-loop。部分活性形式，这个形式特点是 SH3/SH2 的相互作用被破坏，但是 A-loop 仍处于非磷酸化的状态。完全活化的形式，这个形式的特点是 A-loop 处于磷酸化状态。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R341


本文编号：2515365