不同干预条件对大鼠胚胎肝干细胞体外培养影响的实验研究

发布时间：2019-07-18 18:15

【摘要】：干细胞治疗已成为目前国内外生命科学研究的热点之一。能够应用于治疗的干细胞来源很多，其中胎肝中富含具有双向分化潜能的干细胞，被认为是一个重要细胞来源。但由于某些原因如体外分离纯化困难、增殖及分化机制不明等，限制了胎肝干细胞的临床应用。建立快捷、有效的提取方法，以及在培养中调控细胞高效增殖及诱导其定向分化一直是学者们努力的方向。优化胎肝干细胞培养的方法，能够为胎肝干细胞的临床应用研究奠定重要的基础。目的本研究拟探讨体外高效扩增大鼠胚胎肝干细胞的方法。根据细胞外诱导和细胞内诱导可分为两个部分：1、检测可否通过沉默RhoA基因的方法优化胎肝干细胞培养；2、研究不同浓度肝细胞生长因子（hepatocyte growthfactor，HGF）和表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）对大鼠胎肝干细胞体外增殖的影响，探索二者间有无协同作用。方法 1.将取自孕14天胎龄的F344大鼠胚胎肝组织的肝干细胞体外培养，经小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）转染以沉默RhoA基因表达，分为3组：A：胎肝干细胞组；B：经随机打乱顺序的siRNA转染的胎肝干细胞组；C：经特异siRNA转染的胎肝干细胞组。用Western blot及RT-PCR法检测转染前后胎肝干细胞RhoA的蛋白和基因表达。应用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）观察各组细胞生长情况，并采用流式细胞术测定各组细胞周期分布变化。 2.取孕14天胎龄F344大鼠胚胎的胎肝，经三步分离法分离纯化后，配置不同浓度HGF、EGF及HGF和EGF联合组培养基，将胎肝干细胞分组培养。光镜下观察细胞增殖状况，MTT法观察不同浓度和不同时间HGF、EGF及HGF和EGF联合对大鼠胎肝干细胞增殖的影响，并进行统计学分析。结果 1. RT-PCR显示转染特异siRNA组的胎肝干细胞RhoA基因表达量明显降低（p0.05），Western blot显示转染特异siRNA组胎肝干细胞RhoA蛋白表达量明显降低（p0.05），MTT结果显示转染特异siRNA组的胎肝干细胞生长速度明显增快，流式细胞术结果显示转染特异siRNA组细胞处于G0/G1期的细胞减少，，S期细胞数增多，各组间有统计学差异（p0.05）。 2. HGF10~80ng/ml各浓度组，EGF10~80ng/ml各浓度组增殖效应均大于对照组。当HGF为20ng/ml，增殖效应明显大于对照组（p0.01），当HGF浓度继续增高时，增殖效应无明显增高。将20ng/ml HGF组与不同浓度EGF组合后分组培养细胞，发现20ng/ml HGF和10ng/ml EGF联合组增殖效应明显升高，继续升高联合组中EGF浓度，增殖效应无明显提高。结论 1.通过siRNA干扰的方法可以有效的沉默RhoA基因并促进大鼠胎肝干细胞增殖，对其培养有优化作用。 2. HGF和EGF具有明显改善大鼠胎肝干细胞体外无血清培养条件的作用，二者对大鼠胎肝干细胞体外培养具有协同促进作用。其中20ng/ml HGF和10ng/ml EGF联合培养促进大鼠胎肝干细胞增殖效果最明显。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329

【参考文献】