兔着床后全胚胎培养方法和三种纳米材料对小鼠体外发育毒性的研究

发布时间：2019-07-25 07:15

【摘要】：啮齿动物着床后体外全胚胎培养（Whole Embryo Culture，WEC）方法的研究和作为发育毒性实验系统的应用研究已有三十余年，现已经通过了欧洲替代方法验证中心（ECVAM）验证，表明其与体内结果有良好的一致性，被推荐为发育毒性的替代方法之一。而兔全胚胎培养技术发展和应用相对就滞后很多，近年才在方法学有明显突破。有研究资料显示兔全胚胎培养模型在发育毒性研究的某些方面可能优于啮齿类动物，现行发育毒性实验指南中通常要求实验动物需包括啮齿类和非啮齿类动物，而兔是非啮齿类的首选动物。因此，无论作为发育毒性研究，还是发展替代方法，无疑兔全胚胎体外培养模型都具有重要的发展应用前景。而国内还未见建立兔全胚胎培养研究的报道。为此，本研究的目的之一是引进建立兔全胚胎培养模型，并试用于发育毒性研究。纳米材料由于特有的理化和生物学性质，有广泛的应用价值，但也因为与非纳米材料性质的差异，是否会给生产者和使用者造成未知的健康危害成为人们关注的重要问题。发育毒性是各类化学物安全性评价或危险度评估的重要内容之一，现行评价方法是否适合纳米材料的评价是亟待回答的问题。为此，本研究选择三类纳米材料（金属氧化物类、碳纳米管类、有机物）的代表物，利用小鼠全胚胎培养模型研究其发育毒性，并比较了Nano-TiO_2对小鼠和兔的体外发育毒性，目的是揭示纳米材料胚胎发育毒性的特征，为评估现行方法是否适用于纳米材料的决策提供科学依据。本文研究内容分以下三部分。一、兔着床后全胚胎培养模型的建立及其验证采用新西兰孕兔，取GD9孕兔胚胎，参照Carney和Naya的方法稍加修改，主要是在打开子宫壁时改用了从中间向两边切开子宫的方法。剥离胚胎后单瓶培养，形态学评分系统采用Carney建立的兔胚胎形态评分系统。体外培养48h后将观察结果与文献报道的结果进行对比；并用5.0mmol/L浓度的甲氧基乙酸（MAA）作为阳性对照物对所建培养方法作进一步验证。研究结果显示，本研究中23个GD9天龄兔胚胎体外培养48h后，存活率为100%，头长平均增长2.15倍，卵黄囊闭合和胚胎弯曲情况、体节数、自发畸形率、形态评分均数等指标均与文献报道的体外培养发育情况相近。5.0mmol/L浓度的阳性对照MAA能引起兔胚胎明显的发育毒性，包括卵黄囊闭合减少、头部区域肿胀、面部器官缺失、体节紊乱、尾神经管闭合不全等，形态总评分明显低于溶剂对照（P0.05），畸形率为88.24%，畸形类型和畸形率与文献报道一致。结果表明本研究所建立的兔着床后全胚胎培养方法是成功的。二、三种纳米材料对体外小鼠胚胎生长发育的影响取GD8.5的ICR小鼠胚胎，采用小鼠WEC方法，分别用60nm二氧化钛、60nm聚苯乙烯以及不规则形状的单壁碳纳米管在64.0、160.0、400.0μg/mL剂量下培养48h后收获胚胎，解剖镜下观察监测终点,采用Van小鼠胚胎发育评分法对小鼠胚胎进行评分，研究其对小鼠体外胚胎的生长发育影响。 1.纳米二氧化钛（Nano-TiO_2） Nano-TiO_2在受试浓度下，卵黄囊直径、胚胎颅臀长、头长三项生长指标和体节数与对照组间没有明显差异，但畸形率与对照组相比差异有统计学意义（P0.05），而且随着剂量增加畸形率升高，有明显的剂量-反应趋势。在64.0μg/mL浓度开始就观察到胚胎出现发育毒性表现，卵黄囊血循环、体位、心脏、尾神经管、中脑、后肢的评分低于对照组（P0.05）；中剂量组进一步出现后脑发育较差，评分低于对照组（P0.05）；高剂量组除上述组织器官外，头部视觉和嗅觉器官评分明显低于其他各组，而且总形态学评分低于其余各组，与对照组相比有统计学差异（P0.05）。表明随着剂量增加，受影响的胚胎组织器官增多；胚胎组织器官形态分化的受影响程度也有一定加重。 2.纳米聚苯乙烯（Nano-PS） 60nm Nano-PS在64.0、160.0、400.0μg/mL三种浓度下对小鼠胚胎各生长指标情况没有出现明显的影响；畸形率有增加但与对照组比较差异无统计学意义；各剂量组形态学分化评分均低于对照组但没有统计学差异，主要影响心脏、脑、听觉器官及后肢。 3.单壁碳纳米管（SWCNTs）单壁碳纳米管在64.0、160.0、400.0μg/mL受试剂量下，中剂量组严重影响小鼠胚胎体节发育，形态学分化评分也明显降低，畸形发生明显高于其他剂量组，多个器官出现畸形。出现的发育毒性主要表现为：卵黄囊循环血管发育较差、体位翻转不全、体节紊乱、心包积液或发育不良、听觉视觉鳃弓发育不良、后肢芽缺失。低剂量和高剂量组的生长发育指标和组织器官形态分化指标与对照组没有统计学差异。 4.三种纳米材料对小鼠发育毒性的比较 Nano-TiO_2在64.0μg/mL浓度开始就观察到胚胎出现发育毒性；单壁碳纳米管在160.0μg/mL剂量下出现胚胎发育毒性；而Nano-PS在受试剂量下能明显影响少数器官。从致畸性来说，Nano-TiO_2在64.0μg/mL浓度就开始与对照组有统计学差异，并有明显的剂量-反应趋势；单壁碳纳米管仅在160.0μg/mL剂量组与对照组有统计学差异，无明显剂量-反应趋势，但致畸发生率和致畸严重程度均比Nano-TiO_2高。从致畸类型来说，Nano-TiO_2明显影响卵黄囊循环，主要引起中脑、心脏、视觉、嗅觉器官和尾神经管畸形，60nm PS主要影响心脏、脑、听觉器官及后肢，SWCNTs能引起几乎所有的器官畸形，包括脑部、心脏、面部器官、尾神经管等。三、纳米二氧化钛对小鼠和兔体外胚胎发育毒性的比较 Nano-TiO_2在160.0、400.0、1000.0μg/mL剂量下对兔胚胎头长、体节数的生长发育情况没有出现明显的影响，160.0、400.0μg/mL剂量畸形率与对照组有统计学差异，无明显剂量-反应关系趋势；各组的形态学评分均低于对照组，但均无统计学差异。而小鼠各剂量组畸形率与对照组相比差异均有统计学意义（P0.05）；从致畸类型和受影响的组织器官兔和小鼠相近，但小鼠受影响的组织器官更多。通过研究，主要获得以下成果：结论：（1）在国内首先成功引进建立了兔着床后全胚胎培养方法。（2）三类纳米材料均不影响小鼠胚胎存活，对胚胎生长指标没有明显影响，但Nano-TiO_2在64.0μg/mL浓度就可引起体外小鼠胚胎致畸等发育毒性，并有明显的剂量-反应趋势；SWNCT在160.0μg/mL剂量可引起胚胎发育毒性，无明显剂量-反应趋势，但致畸发生率和致畸严重程度均比Nano-TiO_2高；而Nano-PS在受试剂量下仅对形态分化有一定迟缓作用，其发育毒性有待进一步验证。（3）Nano-TiO_2在受试剂量下均可引起兔和小鼠体外胚胎致畸等发育毒性，毒作用特点相近，，但从发生率和引起毒性的剂量及严重性上小鼠比兔似更敏感。
【图文】：

兔着床后全胚胎培养方法和三种纳米材料对小鼠体外发育毒性的研究有卵黄囊外周血管围绕并且有心跳的胚胎进行分离。用虹膜剪将与外周血管连接的远端组织剪断，然后用钝的显微镊小心将带有卵黄囊的胚胎从胎盘上分离出来，无菌玻璃吸管将带羊膜和卵黄囊的胚胎转移到干净的 Hank’s 中清洗，并在显微镜下仔细检查，记录头长，选择有 12-14 体节，外周血管和内脏卵黄囊未被机械性损伤的胚胎进行培养，随机分到各组，将胚胎移入 50mL 培养瓶中，每瓶一个，加入 3mL 培养液，把培养瓶置于恒温旋转培养箱，在 38℃下旋转培养 48h，转速 20～30r/min，分别在培养开始时充入混合气体(5％CO2：20％O2：75％N2)、培养 18h、34h、44h 分别充入混合气体(5％CO2：95％O2)一共四次，每次 2min（图 1）。

兔着床后全胚胎培养方法和三种纳米材料对小鼠体外发育毒性的研究

C D图 2 兔胚胎移植和培养e 2 Transfer and culture the rabbit embryos A.seperate the embryo; B.50mL cultbottle; C.fill the mixture gas; D.rotation culture离；B.50mL 培养瓶；C.充入气体；D.旋转培养、结果观察养 48 h 后收获胚胎，镜下观察存活和胚胎畸形情况并测量头长。采用 Car兔胚胎形态评分系统[19]对兔胚胎器官形态分化进行评分。、致畸阳性物验证甲氧基乙酸（MAA）用 Hank’s 液配成 100×的母液，培养前按照 1%体积加中，终浓度为 5.0mmol/L，胚胎在含阳性物的 ICS 中培养 48h 后，观察其对发育毒性，包括胚胎存活、头长增长、畸形以及形态学发育情况（卵黄囊循
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R321

【参考文献】