抗蓖麻毒素对可变区抗体的构建和机制研究

发布时间：2019-07-25 12:09

【摘要】：蓖麻毒素是存在于蓖麻籽油中的植物毒素。这种毒素由A和B两个亚基组成，并通过一条二硫键连接在一起。蓖麻毒素B亚基是一种半乳糖特异性的凝集素，能够结合细胞表面含糖脂或糖蛋白的受体。这些结合的毒素随后通过宿主细胞依赖的内化机制和从内吞小体向内质网的内质网逆向运输机制被运入细胞质。在进入内质网后，蓖麻毒素必须在蛋白质二硫键异构酶（PDI）的作用下，将A，B亚基间的二硫键还原，此后A亚基才能露出其酶活性位点。当RTA转移到达细胞质后，它的糖苷酶活性位点能够识别rRNA上高保守的α-sarcin环，阻碍多肽延伸并导致细胞的死亡。因为其具有高致死和易于散播获得的特性，蓖麻毒素被认为是一种可能被用于生化攻击的生物战剂。目前，尽管已经有许多中针对这一威胁的治疗方法以及被发展出来，但特异性的抗体治疗仍旧是一种最特异和最高效的治疗方法。 之前曾经有报道称两株或更多单克隆抗体的联合使用能够增加抗体的保护效果，同时，我们在制备抗蓖麻毒素单克隆抗体的过程中也发现了类似的现象。当我们将两株抗RTA的单克隆抗体6C2和抗RTB的单克隆抗体3E1联合使用后，我们发现抗体的在体内和体外的保护水平都得到了提高。在过去十年中随着对传统抗体临床知识的成熟，人们开始试图发展出下一代抗体以期提高抗体的效果。下一代抗体的种类有许多，而双特异性抗体是其中最受重视的一种。双特异性抗体一个关键的能力是能够一个分子同时中和保护两个不同的目标，例如配体，受体，或细胞因子。除此之外，双特异抗体还能通过识别一个抗原分子上的不同表位来增加抗原特异性和保护效果。 在我们的课题中，我们设计了一种含有6C2和3E1可变区和人Fc区的双特异性抗体，具有一个臂结合两个抗原的能力，我们称之为DVD抗体。在随后的工作中，我们证实这种新的DVD抗体保留了亲源抗体所有的特性和功能：包括识别RTA和RTB的能力，阻碍RTA酶活性的能力，阻碍RTB结合细胞表面糖蛋白和糖脂的能力。细胞毒性实验和小鼠保护实验显示DVD抗体，其保护作用有明显的提高：比单个抗体的保护效果至少多了10倍，甚至比嵌合的6C2和3E1的联合使用效果还好了3倍。结合相同表位的抗体的效果一般被认为与抗原抗体之间的亲和力有关。然而，和我们的发现不同的是，DVD抗体和6C2抗体，3E1抗体的动力学参数之间并没有特别大的差别。所以，在此后的研究中我们合理的质疑DVD抗体可能还通过一些其他我们所不知道的机制保护机体免受毒素攻击。 RICIN发挥作用的必要条件是细胞质中游离RTA的存在。全毒素在内质网中向内质网外释放RTA的过程中，PDI对RTA-RTB间二硫键的解离是其关键步骤。DVD和两株传统的单克隆抗体之间最大的差别是他能够用一个抗体臂同时抓住RTA和RTB。随后，我们在无细胞体系中用western blot和SRP分析证实了DVD抗体能够导致链间二硫键无法被还原。除此之外，还有一个明显的证据就是DVD抗体能够使RTA在内质网中滞留，而其他的抗体包括6C2和3E1抗体的联合应用都不能引起相同结果。基于以上结果，我们认为当DVD抗体和毒素一起被吸收进入内质网时，二硫键被PDI还原的过程被DVD干扰了。这应该是DVD抗体动力学数据和单个抗体类似，但保护效果优于其他抗体的合理解释。
【图文】：

抗蓖麻毒素双功AAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGK V Y A C E V T H Q G L SACAGGGGAGAGTGTN R G E C单克隆抗体 6C2,3E1 轻重链可变区 5抗体轻重链可变区基因是构建嵌合抗体的基，我们采用 5’RACE 法对鼠源单克隆抗体 行了两轮 PCR 扩增，扩增最终产物大小约1 2 M 3 4

图 1-2 轻重链可变区 T 载体克隆酶切鉴定结果M：DNA maker II；Lane 1,2：3E1 VL 克隆；Lane 3,4：3E1VH 克隆；Lane 1,2：6C2VL 克隆；Lane3,4：6C2VH 克隆4、3E1，6C2 轻链和重链可变区序列测定结果—500将酶切正确的重组质粒进行序列测定。结果显示，6C2 抗体重链可变区全长共有408 个核苷酸，前 57 个编码前导序列。轻链可变区共有 387 个核苷酸，前 66 个编码前导序列；3E1 抗体重链可变区全长共有 429 个核苷酸，前 57 个编码前导序列。轻链可变区共有 381 个核苷酸，，前 60 个编码前导序列。3E1 重链可变区核苷酸序列和推导的氨基酸序列1 ATGGAATGGACCTGGGTCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTAACTGCAGGTGTCCACTCCCAG
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392

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本文编号：2519076