阴道毛滴虫携病毒与无病毒株差异蛋白比较研究

发布时间：2019-07-25 20:18

【摘要】：阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis, TV)是寄生在人体泌尿生殖道系统,主要引起女性的滴虫性阴道炎,男性的尿道炎及不育等症状,此外,阴道毛滴虫还可以引起其他动物如小鼠成为带虫者,松鼠猴表现出临床症状,且呈现世界性分布,是一种危害人兽健康的重要人兽共患寄生性原虫。阴道毛滴虫病毒(Trichomonas vaginalis Virus, TVV)的发现为阴道毛滴虫细胞分子生物学研究开辟了新道路,而本实验室阴道毛滴虫病毒载体的构建成功使导入外源基因得以实现,也为蛋白质功能研究提供了新方法。尽管有研究表明阴道毛滴虫病毒颗粒的感染对阴道毛滴虫致病性、毒力以及耐药性等方面均呈现一定影响,但对虫体蛋白质表达上研究尚未见报道,所以本研究首次对阴道毛滴虫携病毒与无病毒虫株之间蛋白表达差异进行比较研究,获得两者之间差异蛋白谱。 本试验应用肝浸汤培养基对阴道毛滴虫携病毒与无病毒虫株进行体外纯培养,同时为排除病毒颗粒对试验的影响,利用CsCl密度梯度超速离心提取阴道毛滴虫病毒颗粒,通过超声破碎方法提取三者总蛋白进行比较；通过iTRAQ技术,经nanoLC分离系统得出的数据分析得到阴道毛滴虫携病毒与无病毒之间蛋白表达差异；并应用荧光定量PCR技术检测差异蛋白磷酸丙糖异构酶(TVTPI)基因在mRNA水平上差异情况以及利用锤头状核酶经电穿孔转染导入虫体体内后验证差异蛋白TVTPI的功能。 试验结果显示,阴道毛滴虫携病毒与无病毒虫株之间共鉴定出270种蛋白,其中有50种蛋白存在表达差异,包括多种类型蛋白,而大多在携病毒虫株中呈现上调；荧光定量PCR检测结果显示差异蛋白TVTPI在]mRNA水平上存在显著差异,无病毒虫株的表达量为携病毒虫株的58.00%,说明阴道毛滴虫病毒感染后上调虫体TVTPI基因转录水平表达；同时设计合成了针对于TVTPI基因的的锤头状核酶73nt,并连接到阴道毛滴虫病毒载体上得到pNEO/73nt进行体内和体外对TVTPI基因切割研究,体外试验表明pNEO/73nt体外转录体对TVTPI体外转录体起到有效切割作用,切割效率达到82.19%,而同时设计的反义TVTPI片段pNEO/TPI对TVTPI基因体外转录体的影响作用较小,仅为35.5%,为进行体内试验提供了理论基础；通过电穿孔转染方法,将pNEO/73nt体外转录体导入阴道毛滴虫体内,荧光定量PCR检测在体内pNEO/73nt对TVTPI基因切割效果为75.20%,虫体计数结果显示,转染后虫体生长情况显著低于正常水平(P0.01),染色观察虫体有轻微的形变,表明磷酸丙糖异构酶对虫体成长起到明显影响,说明TVTPI是阴道毛滴虫体内一种重要的功能性蛋白。 本试验为进一步研究阴道毛滴虫病毒感染对阴道毛滴虫与宿主的致病机制、耐药性、毒力等方面影响,及阴道毛滴虫蛋白质组学研究提供理论基础。
【图文】：

2.1阴道毛滴虫无病毒株筛选阴道毛滴虫两种虫株总核酸提取样品琼脂糖凝胶电泳检测分析，可以看到阴道毛滴虫无病毒株只有总基因组条带而无病毒条带。(见图1一1)图1一l:阴道毛滴虫携病毒与无病毒株总核酸 F191一 1AgarosegeleletroPhoreticanalysisoftotalnucleicacidfromT，乓刀nalisM:15000markerl:阴道毛滴虫携病毒株2:阴道毛滴虫无病毒株 M:15000markerl:TvaginalisinfeetedwithTI/J尸2:Tvag之naliswithoutT卜 FinfeCt10n2.2阴道毛滴虫形态观察用显微镜观察到培养虫体12h后，即可在培养基底部看到有虫体生长;24h后，大量繁殖，数目可以达到12h的4倍;36h后，虫体生长呈对数期，虫体生长活跃:48h后，，整个培养基中均可以看到虫体，但活力减弱且培养基底可以看到有死虫;60h后，虫体变为圆形，活力极度下降;72h后虫体大量死亡。用瑞氏与姬氏混合液染色可见阴道毛滴虫呈梨形或椭圆形，位于虫体前端的细胞核

平衡标签及氨基酸反应标签。其中报告标签基团由四个分别为114、115、116、117Da大小分子量组成，质量平衡标签是由分子量分别为31、30、29、28Da组成(见图2一2)，而氨基酸反应标签相同均是由一个相同的多肤反应基团(NHS)组成。反应的基本原理是由NHS和多肚中的氨基端或者和多肤链中的赖氨酸残基上的氨基进行共价反应，进而对多肤进行标记。这样既可以同时对四个样本同时进行定量分析，而汀RAQ最大的优势就在于能够对蛋白进行绝对的定量，合成相应的肤段，使用其中一种标签进行肤段标记，利用相对定量的结果，以及合成肤的绝对量来实现对蛋白质的绝对定量。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：S852.7;R382.21

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 裘智勇;赵巧玲;刘挺;覃光星;沈兴家;郭锡杰;;两个对浓核病毒(镇江株)具感性差异的家蚕品种的血液和围食膜蛋白的比较[J];基因组学与应用生物学;2011年03期

2 王维君;;分级提取蛋白技术在蛋白质组学中的应用[J];农产品加工(学刊);2011年08期

3 胡新明;杨友才;潘映红;;小麦叶片胞间洗脱液的蛋白质组学检测分析[J];生物技术通报;2011年08期

4 付凡;赵巧玲;裘智勇;夏定国;唐顺明;沈兴家;;家蚕幼虫正常个体与眠性变化个体大眠蜕皮前后血液蛋白质差异表达分析[J];蚕业科学;2011年05期

5 进茜宁;付志远;丁冬;刘宗华;李卫华;汤继华;;玉米杂交种先玉335及其亲本种子萌发过程中胚芽蛋白质组学分析[J];作物学报;2011年09期

6 王勇;李彦卓;王伯阳;姜义仁;杨瑞生;樊虹;秦利;;柞蚕胚胎发育期蛋白质的2D-PAGE图谱分析[J];蚕业科学;2011年04期

7 ;[J];;年期

8 ;[J];;年期

9 ;[J];;年期

10 ;[J];;年期

相关会议论文 前10条

1 王珊;高志红;章镇;徐军霞;侯计华;;果梅完全花与不完全花的差异蛋白分析(摘要)[A];第二届全国果树分子生物学学术研讨会论文集[C];2009年

2 王志华;李鑫;;应用SELDI蛋白质芯片技术对高低转移肺腺癌细胞差异蛋白的初步筛查[A];第九届全国肿瘤生物治疗学术会议论文集[C];2006年

3 林祥明;林建峰;贺量;张茜;傅婉辉;陈清西;石艳;;菜青虫不同生长期相关蛋白的蛋白质组学研究[A];中国生物化学与分子生物学会农业生物化学与分子生物学分会第八次学术研讨会论文集[C];2008年

4 吴正正;严京;;蛋白质组学方法分析STZ诱导Ⅱ型糖尿病大鼠模型后视网膜差异蛋白变化[A];中华中医药学会第五次眼科学术交流会论文汇编[C];2006年

5 罗莹;杨云生;郭旭;彭丽华;王巍峰;孙刚;;便秘型肠易激综合征结肠黏膜组织差异表达蛋白质的筛选与鉴定[A];中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编（上册）[C];2007年

6 吴正正;严京;;蛋白质组学方法分析STZ诱导Ⅱ型糖尿病大鼠模型后视网膜差异蛋白变化[A];中华医学会第十二届全国眼科学术大会论文汇编[C];2007年

7 李岩;康晓楠;郭坤;李雪飞;刘银坤;;小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞的蛋白质组学分析[A];第十二届全国肝癌学术会议论文汇编[C];2009年

8 王志华;李鑫;;应用SELDI蛋白质芯片技术对高低转移肺腺癌细胞差异蛋白的初步筛查[A];2006年全国生化与生物技术药物学术年会论文集[C];2006年

9 聂作明;龙晓辉;贺平安;王丹;陈健;吕正兵;徐杰;陈芳;吴祥甫;张耀洲;;蚕孤雌生殖相关蛋白Elongation factor和HSP23．8的质谱鉴定、基因克隆与分析[A];华东六省一市生物化学与分子生物学学会2006年学术交流会论文集[C];2006年

10 张文平;吕正兵;聂作明;龙晓辉;夏佳音;陈健;徐杰;盛清;王丹;吴祥甫;张耀洲;;家蚕有性生殖和孤雌生殖差异蛋白磷脂酰肌醇蛋白聚糖基因的克隆和序列分析[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2008年学术交流会论文摘要汇编[C];2008年

相关重要报纸文章 前10条

1 樊凤辉;美国绘制阴道毛滴虫基因组草图[N];医药经济报;2003年

2 北京煤炭总医院泌尿外科主任医师 钟伟;阴道毛滴虫：非女人专利[N];健康时报;2003年

3 吴一福;军事医学科学院从MSCs中筛选出重要差异蛋白[N];中国医药报;2006年

4 肖梅;炎症也会引发不孕？[N];健康时报;2009年

5 吴登梅;类似淋病非淋病[N];中国医药报;2000年

6 陕西中医学院 贺丰杰;中西医结合妇科研究要有创新思维[N];中国中医药报;2010年

7 杨燕贻;孕期请保姆 体检查滴虫[N];大众卫生报;2004年

8 山东平阴县卫生局副主任医师 朱本浩;女阴瘙痒原因多[N];大众卫生报;2009年

9 钟佳琳;浅论临床治疗滴虫性阴道炎的体会[N];农村医药报（汉）;2009年

10 本报记者 王峰;性病用药 莫因恐慌入误区[N];中国消费者报;2001年

相关博士学位论文 前10条

1 柳金顺;肾细胞癌差异蛋白质发现与筛选的实验研究[D];北京协和医学院;2009年

2 罗勇;瘢痕疙瘩差异表达基因的筛选及标志蛋白的分析[D];第一军医大学;2005年

3 周继红;应用表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术筛选肺癌差异蛋白的研究[D];广西医科大学;2010年

4 李莉;蛋白质组学技术对胃癌、肝癌、卵巢癌血清差异蛋白表达的研究[D];新疆医科大学;2011年

5 徐洪;Ac-SDKP抗矽肺纤维化作用的新靶向—肌成纤维细胞分化和差异蛋白的筛选[D];河北医科大学;2012年

6 徐红波;基于iTRAQ技术筛选抑郁症相关血浆蛋白和氨基酸的初步研究[D];重庆医科大学;2012年

7 杨旭芳;人脂肪干细胞的获取及其定向分化为内皮细胞差异蛋白筛选的实验研究[D];吉林大学;2010年

8 林强;SELDI-TOF-MS筛选差异蛋白在肺部良恶性疾病鉴别及临床决策中的研究[D];苏州大学;2010年

9 郭静会;胰腺癌血清蛋白质指纹图谱及CCR7与胰腺癌淋巴结转移相关性研究[D];复旦大学;2010年

10 徐红梅;卵巢上皮性癌差异蛋白的筛选及信号通路研究[D];吉林大学;2010年

相关硕士学位论文 前10条

1 丁鹤;阴道毛滴虫携病毒与无病毒株差异蛋白比较研究[D];吉林大学;2011年

2 龙强;龙眼（Dimocarpus longan Lour.）成花逆转蛋白质组学的初步研究[D];福建农林大学;2006年

3 王丽娟;阴道毛滴虫内双链RNA病毒的寄生及其对阴道毛滴虫相关特性影响的研究[D];郑州大学;2011年

4 刘彦红;卵巢浆液性囊腺癌及囊腺瘤的差异蛋白质组学分析[D];吉林大学;2010年

5 刘小芝;硼处理对锥栗叶片及胚中差异蛋白的影响[D];福建农林大学;2010年

6 朱传智;基于iTRAQ技术的结核分枝杆菌定量蛋白质组学研究[D];西南大学;2012年

7 张朋;乳腺癌术后骨转移患者血清差异蛋白的MALDI质谱分析[D];新疆医科大学;2011年

8 杨健;溴甲酚紫法体外测试药物抗阴道毛滴虫活性的实验研究[D];昆明医学院;2003年

9 吕慧;AFB_1/HBV双暴露相关肝癌分子标志物的筛选及差异蛋白的表达验证[D];广西医科大学;2012年

10 马蕾;单管巢氏聚合酶链反应检测性病患者阴道毛滴虫感染的研究[D];吉林大学;2005年

本文编号：2519325