细胞自噬及其microRNAs调控分子的筛选与验证

发布时间：2019-08-01 15:17

【摘要】：背景与目的 自噬是细胞成份的自我降解过程，它是存在于真核细胞中一种普遍的生命现象。自噬可以实现细胞内环境稳态，并且与多种疾病的发生发展具有密切的关系。microRNAs是一类由DNA转录产生，不翻译成蛋白质的小调控RNA。它通过与靶mRNA的序列互补，以降解靶mRNA或抑制其翻译。近来研究表明microRNAs参与生物体的一系列生物过程，而且microRNAs在癌症、神经退行性疾病、感染、衰老、心脏病等多种疾病的发生发展过程中起着重要的作用。最近已有报道，microRNAs可以调控自噬过程中自噬相关蛋白的表达。本研究通过系列生物信息学方法，筛选对自噬过程有潜在调控作用的microRNAs，并通过相关生物学实验进行验证。同时利用回转器模拟微重力效应，探究神经细胞自噬与微重力之间的关联性。 方法 利用生物信息学方法预测出可能参与自噬调控的microRNAs。利用雷帕霉素分别诱导乳腺癌细胞MCF7、卵巢癌细胞SKOV-3 12h以使细胞产生自噬。microRNAs模拟物或microRNAs抑制剂转染细胞，此时microRNAs过表达或低表达，然后观察细胞中微管相关蛋白1轻链3（LC3）的表达水平。回转模拟微重力的细胞学效应，回转条件下培养人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 12h、24h，相同条件下静止培养的细胞作为对照组。Western Blotting方法检测LC3蛋白表达水平。荧光显微镜观察绿色荧光标记的LC3（GFP-LC3）点状聚集物变化。 结果 （1）建立自噬诱导的模型：雷帕霉素处理细胞12h以诱导自噬，雷帕霉素组中GFP-LC3点状聚集物多于对照组分别体现在MCF7细胞（P 0.05）和SKOV-3细胞（P 0.001）中。MCF7细胞中雷帕霉素+氯化铵组GFP-LC3点状聚集物显然高于其余各组（P 0.01）。Western Blotting检测MCF7细胞和SKOV-3细胞中LC3蛋白表达水平，与对照组相比，雷帕霉素组皆显示LC-II表达升高。MCF7细胞中雷帕霉素+氯化铵组LC3-II表达增多更为显著。 （2）筛选出与自噬相关的microRNAs为miR-142-5p，经生物实验验证miR-142-5p对雷帕霉素诱导的MCF7细胞自噬中LC3表达无明显影响； （3）筛选与卵巢癌细胞自噬有关的4个microRNAs中，其中一个microRNA在雷帕霉素诱导SKOV-3细胞情况下，瞬时转染microRNAs模拟物或microRNAs抑制剂，Western Blotting结果中microRNAs模拟物可降低LC3蛋白的表达水平，反之，microRNAs抑制剂可使LC3蛋白表达水平升高。荧光显微镜下观察到，microRNAs模拟物使细胞中GFP-LC3点状聚集物减少，而microRNA抑制剂物却增加了GFP-LC3点状聚集物的聚集。而且其余3个microRNAs模拟物对SKOV-3细胞中LC3表达无显著变化； （4）Western Blotting结果显示SH-SY5Y细胞的LC3-II蛋白表达回转组高于对照组回转+氯化铵组显著高于回转组和对照组，荧光显微镜下观察到GFP-LC3点状聚集物随之增多。结论 雷帕霉素可以诱导SKOV-3细胞和MCF7细胞产生自噬效应，miR-142-5p对MCF7细胞的自噬无明显作用。而筛选出的与卵巢癌细胞自噬有关的4个microRNAs中亦有一个microRNAs对SKOV-3细胞自噬有影响，其余3个microRNAs对SKOV-3细胞自噬无统计学意义。自噬相关microRNAs分子的筛选鉴定，可以促进自噬分子机制的认识。模拟微重力可诱导SH-SY5Y细胞中自噬体增多，故自噬对神经细胞产生的影响可能为航天医学的研究提供一个新的线索。
【图文】：

图 2.1 细胞自噬的三种主要形式（摘自：Bejarano et al. ProAm Thorac Soc, 2010）.1.3 自噬相关基因 Atg酵母是最早用于研究自噬的模式细胞，，也是自噬研究较为深入的细胞。目前至少7 个酵母自噬相关基因为我们所知，许多基因的相关功能也已被报道，而且大多数自关基因在果蝇、线虫、哺乳动物等多种物种中具有保守性。起初这些基因被称为 Aput，或 Cvt，现在统一命名为自噬相关基因 Atg（autophagy-related gene）[37]。自噬基克隆始于酵母，1997年日本科学家Yoshinori Ohsumi小组克隆出第一个酵母自噬基因名为 Atg 1[38]。伴随着研究的发现，一些存在于酵母中的自噬相关基因的同源物亦哺乳动物中发现，并且已被分离成功鉴定。哺乳动物中自噬相关基因的命名与酵母，但由于自噬研究的历史原因，一些基因在酵母和哺乳动物中有不同的命名。19美国科学家 Beth Levine 小组克隆出第一个哺乳动物自噬基因[39]，命名为 Beclin

图 2.2 细胞自噬体的形成过程（摘自：Maiuri et al. Mol Cell Biol, 2007）表 2.1 自噬形成过程中所参与的关键蛋白（摘自：Mizushima et al. Cell, 2010）
【学位授予单位】：中北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R346

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本文编号：2521827