MCMV感染同种异型皮肤移植小鼠急性间质性肺炎模型的建立

发布时间：2019-08-01 08:17

【摘要】：目的建立小鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus,MCMV)经鼻腔感染同种异型皮肤移植BALB/c小鼠急性间质性肺炎模型。方法(一)建立同种异型皮肤移植BALB/c小鼠模型:采用21只供体C57BL/6与84只受体BALB/c雌鼠,背部皮肤移植后,每只小鼠腹腔注射环孢素(CsA,15mg/kg),连续给药14d,在此期间,每天观察移植小鼠的生存状况和皮肤存活状况;在第14d,通过ELISA法检测小鼠血浆中IFN-γ水平。 (二)建立MCMV感染受体小鼠急性间质性肺炎模型:(1)实验分组:将移植14d后的受体小鼠随机分为5组(n=16),实验组为4组分别以1×102 PFU/ml/只(A组),1×103 PFU/ml/只(B组),1×104 PFU/ml/只(C组),1×105PFU/ml/只(D组)不同剂量MCMV悬液鼻腔接种受体BALB/c小鼠,另一组为正常对照组(E组),每只小鼠鼻腔接种原代小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF)悬液50μl/只。(2)检测方法:在感染病毒后逐日观察小鼠的一般变化;并在感染后第5,9,14和21d,无菌取小鼠肺组织分别做HE染色,MCMV病毒分离,透射电镜,PCR,RT-PCR检测MCMV即刻早期基因(IE)和晚期基因(M55)的转录产物和Real timePCR检测MCMV IE DNA拷贝数,以及原位杂交和免疫组织化学试验等方法。结果(一)同种异型皮肤移植受体小鼠在移植术后观察BALB/c小鼠在连续14d给药期间,部分小鼠活动能力下降、体重减轻,部分小鼠移植皮片有毛发生长,大部分移植小鼠移植处可见皮下血管化形成,皮片平均存活时间(MST)为13.5±0.3d。在移植14d后,通过ELISA法检测发现受体小鼠比正常小鼠血浆中IFN-γ水平明显降低(p0.05),表明移植受体小鼠处于免疫抑制状态,同种异型皮肤移植成功。 (二)(1)观察感染后各组小鼠的生存状态,D组小鼠相比其他组有明显的嗜睡、厌食、体重下降;用统计软件分析各组小鼠体重指标,显示D组与其他组之间存在显著差异(P0.01)。(2)各感染组肺组织经HE染色,观察各组小鼠肺组织病理变化,发现C组和D组小鼠肺组织有局灶性的病理损害,并发现感染第14和21d后D组肺组织病理改变最明显表现为:肺泡内出血、肺泡壁增宽、肺泡破裂形成肺大疱、肺上皮细胞肿大,肺间质有炎性细胞浸润、肺泡腔变小,以及在肺叶边缘有代偿性肺气肿产生;(3)病毒分离:各组小鼠在感染后第5,9,14,21d均取肺组织匀浆接种MEF细胞盲传3代后,C组和D组在第5,9,14d可见细胞病变效应(CPE),阳性率分别为37.5%和62.5%,低剂量组未见CPE;(4)在感染后的5,9,14,21d,检测各感染组MCMV IE和M55 DNA和RNA转录产物,结果为各感染组MCMV IE和M55 DNA均为阳性;各感染组MCMV IE mRNA转录产物为阳性,在感染后的9,14,21d,M55 mRNA转录产物阳性率分别为43.8%,62.5%,75%,病毒处于活动性感染状态;(5)Real timePCR检测各感染组小鼠肺组织中MCMV IE DNA拷贝数发现高剂量组(C和D组)在21d内病毒拷贝数有明显的变化,在第5和9d高于第14和21d,第9d达到峰值,此时C组最高拷贝数为(1.35±0.10×104copies/μg),D组最高拷贝数为(5.57±0.15×104copies/μg),且D组病毒拷贝数最高,在感染第14d,C和D组病毒拷贝数分别为1.81±0.24×102copies/μg和2.05±0.05×103copies/μg,病毒拷贝数相对有所降低,低剂量组(A和B组)MCMV IE DNA拷贝数变化不明显;(6)经透射电镜检测各组小鼠肺组织可见C组和D组上皮细胞内有疱疹样病毒颗粒;(7)发现C和D组小鼠肺组织原位杂交和免疫组织化学检测均在肺间质上皮细胞中检测病毒特异性核酸和蛋白,而在正常对照组小鼠肺组织中均为阴性。结论(一)依据小鼠移植皮肤的存活时间和免疫抑制状态确定建立了同种异型皮肤移植小鼠模型。 (二)在感染MCMV后的不同时间,对各组受体小鼠肺组织的HE染色、透射电镜、原位杂交和免疫组化检测,可见病毒存在肺组织上皮细胞内,高剂量组肺组织病理检测可见典型的间质性肺炎样病变,并发现感染后14和21d肺组织损伤较为严重;通过病毒分离,PCR,RT-PCR和Real timePCR等检测,可见病毒IE和M55 DNA,mRNA存在,即病毒处于活动性感染状态,感染后高剂量组病毒拷贝数变化较明显,第9d病毒拷贝数最高,第14和21d病毒拷贝数相对减少,第21d后病毒可能趋于潜伏状态。综上所述,本研究成功建立了模拟自然感染状态下同种异型皮肤移植后MCMV感染所致的小鼠急性间质性肺炎模型。
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安徽医科大学硕士学位论文果种异型皮肤移植小鼠模型移植受体小鼠的移植物的存活状态同种异型皮肤移植受体小鼠在移植术后观察 BALB/c 小鼠在连续 1部分小鼠活动减缓、体重下降，大部分移植小鼠移植处可见皮下血小鼠移植皮片有毛发生长，皮片平均存活时间(MST)为 13.5±0.3d，明显的排斥反应，皮肤移植成功，见图 1。ABCC57BL/6BALB/c 注射 CsA 前

MCMV感染同种异型皮肤移植小鼠急性间质性肺炎模型的建立

与正常小鼠相比，小鼠皮肤移植后机体表 4.小鼠血浆中 IFN-γ Tab 4. the IFN-γ levels in plasma of组x±S（pg/ml）小鼠 26.073±0.92小鼠 22.753±0.51试验验测定结果，，见图 2，计算出 MCMV 病毒悬m1，分装为 1ml/管后于-80℃保存备用。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R-332

【参考文献】