miR-873调控IL-17诱导的小鼠星形胶质细胞产生炎症与趋化因子的机制研究

发布时间：2019-08-06 18:41

【摘要】：目的：探讨IL-17体外刺激小鼠星形胶质细胞诱导某些炎性因子、趋化因子的生成和相关调控蛋白的表达以及体外、体内（EAE小鼠）微小RNA（microRNA，miRNA）表达谱的变化。方法：体外培养的C57BL/6小鼠原代星形胶质细胞，用IL-17刺激（50ng/ml）后3h、6h、12h、24h和48h，行real-time PCR和ELISA方法检查小鼠星形胶质细胞合成白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及巨噬细胞炎症蛋白-2（macrophageinflammatory protein-2，MIP-2）、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotacticprotein-1，MCP-1)和MCP-5的变化；同时用Western blot检查IL-17刺激星形胶质细胞后，上述各时间点A20（又称tumor necrosis factor α inducible protein3，TNFAIP3）及磷酸化的NF-B p65亚基（p-NF-B/p65）蛋白的表达水平。此外，用miRNA芯片筛查IL-17刺激原代星形胶质细胞后3h、6h及EAE模型小鼠发病14d、20d时脑组织中miRNA表达谱的变化；并用Western blot和荧光素酶报告基因技术确证能调控A20表达的miRNAs。结果：（1）IL-17刺激星形胶质细胞后6h，其IL-6、TNF-α和MIP-2、MCP-1/5的mRNA及蛋白表达水平均显著升高，且蛋白表达在刺激后12h达到峰值；（2）IL-17刺激星形胶质细胞后6h，A20的蛋白表达显著下调，但此时p-NF-B/p65的表达水平则处于高峰，与前述炎性因子及趋化因子的表达时相基本一致；（3）体内外的miRNA芯片分析表明，用IL-17刺激星形胶质细胞后3h和6h，高于对照组1.5倍以上的miRNAs共有98个，低于对照组0.5倍以下的miRNAs共有62个；而在抗原诱导的EAE模型小鼠（14d和20d）脑组织中，高于对照组1.5倍以上的miRNAs共有90个，而低于对照组0.5倍以下的miRNAs共有42个；另体内外共同上调的miRNAs为36个；（4）筛选出的与A203'-UTR能够互补配对，且上调的miRNAs（即miR-323-5p、miR-763、miR-141、miR-139-5p和miR-873）转染至星形胶质细胞后48h，结果显示，miR-323-5p、miR-763和miR-873能明显抑制A20的表达，并能降低野生型重组A20（pGL3-Promoter/WTA20）3'-UTR荧光素酶的活性，其中以miR-873的作用最为显著。结论： IL-17刺激小鼠原代星形胶质细胞后能诱导IL-6、TNF-α和MIP-2、MCP-1/5的合成与分泌，同时伴有A20的表达下调和p-NF-B/p65的表达增加；体外用IL-17刺激星形胶质细胞（3h、6h）和体内取EAE小鼠（14d、20d）脑组织共同筛出的miR-323-5p、miR-763和miR-873均能显著抑制A20的蛋白表达，尤以miR-873的作用较为明显。目的：体外探讨miR-873调控IL-17刺激小鼠原代星形胶质细胞后产生某些炎性因子和趋化因子的作用及机制。方法：体外培养的C57BL/6小鼠原代星形胶质细胞用miR-873或miR-873的长效抑制剂（LNA-anti-miR-873）转染后48h，再行IL-17（50ng/ml）刺激6h，用real-time PCR和ELISA方法检查其对IL-17诱导星形胶质细胞产生IL-6、TNF-α与MIP-2、MCP-1/5的影响；同时，用Westernblot检查miR-873和LNA-anti-miR-873转染后的细胞，其A20及p-NF-B/p65蛋白的表达水平。此外，用miR-873种子区突变（Mut-miR-873）和与种子区互补结合的A20基因3'-UTR突变（pGL3-Promoter/Mut A20）的荧光素酶报告质粒转染星形胶质细胞，测定其荧光素酶的活性，以鉴定A20为miR-873靶向调控的目标蛋白。另合成发夹状的A20小干扰RNA（A20shRNA）并转染至星形胶质细胞，在沉默A20基因的表达后再检查其对IL-17诱导的星形胶质细胞产生上述炎性和趋化因子及p-NF-B/p65表达的影响；再者，用PDTC（NF-B活性抑制剂）处理星形胶质细胞后2h，再用IL-17刺激6h，观察其对前述炎性因子与趋化因子生成的抑制作用。结果：（1）miR-873转染至星形胶质细胞后，，IL-6、TNF-α和MIP-2、MCP-1/5的mRNA及蛋白水平均明显升高；而转染了LNA-anti-miR-873后，上述炎性因子与趋化因子的mRNA和蛋白水平均显著降低。同时，miR-873转染组A20的表达显著下调，而p-NF-B/p65的表达水平则明显升高；（2）野生型miR-873（WT-miR-873）和重组载体pGL3-Promoter/WTA20共转染星形胶质细胞后，能显著降低pGL3-Promoter/WT A203'-UTR荧光素酶的活性，而Mut-miR-873转染细胞后并未影响A203'-UTR的荧光素酶活性；另WT-miR-873或Mut-miR-873与pGL3-Promoter/Mut A20共转染细胞后， pGL3-Promoter/Mut A203'-UTR荧光素酶的活性均未见明显改变；（3）A20shRNA质粒转染星形胶质细胞后，其前述炎性因子与趋化因子的分泌量均明显升高，且p-NF-B/p65的表达亦显著增强。除此之外，用PDTC抑制NF-B活化后，星形胶质细胞产生上述炎症和趋化因子的水平也明显下调。结论：miR-873能够通过影响A20的表达和NF-B的活化调控由IL-17刺激星形胶质细胞诱导的IL-6、TNF-α、MIP-2和MCP-1/5的生成。目的：探讨miR-873体内调控小鼠EAE炎性病变的效应。方法：使用抗原MOG35-55复制C57BL/6小鼠EAE模型，行real-time PCR检查EAE小鼠病变过程中脑组织的miR-873、IL-17、IL-6、TNF-α及MIP-2、MCP-1/5的mRNA丰度，ELISA方法测定血清中上述炎性因子和趋化因子的分泌水平，同时用Westernblot检查小鼠脑组织中A20和p-NF-B/p65蛋白的表达变化。此外，构建miR-873过表达（LV-miR-873）和表达抑制（LV-sponge）的慢病毒表达载体，并经尾静脉注射入小鼠体内，用real-time PCR和ELISA法检查miR-873对EAE小鼠产生前述炎性因子和趋化因子的影响；并用Western blot和免疫组化的方法检查给予了LV-miR-873或LV-sponge的EAE小鼠，其脑组织和脊髓组织中A20和p-NF-B/p65表达的变化。另用HE和LFB染色，光镜下观察LV-miR-873和LV-sponge感染后的EAE小鼠，其脊髓中炎症细胞浸润和髓鞘损伤的程度；同时用电镜观察不同处理后的EAE小鼠髓鞘超微结构的改变。结果：（1）抗原MOG35-55复制出小鼠EAE模型后，随着发病时间的延长，miR-873的水平逐渐升高，且前述炎性因子和趋化因子的表达水平亦明显上升，抗原给予20d时这些因子仍旧处于较高水平；与此同时，A20在EAE小鼠脑组织中的表达明显下降，而NF-B活化的水平（即p-NF-B/p65的表达）则显著增强。（2）LV-miR-873感染后的EAE小鼠，其IL-6、TNF-α及MIP-2、MCP-1/5的含量均明显高于LV-ctrl感染的EAE小鼠，而LV-sponge处理的EAE小鼠，这些炎性因子和趋化因子的分泌水平均显著减少；此外，LV-miR-873感染后的EAE小鼠，其脑和脊髓组织中A20的蛋白表达均明显降低，但p-NF-B/p65的表达水平则明显升高。（3）LV-miR-873感染后的EAE小鼠，其临床症状的发生提前并加重，HE染色的结果显示，LV-miR-873感染后的EAE小鼠，其脊髓部位有大量的炎性细胞浸润，而LV-sponge感染的小鼠，其炎性细胞浸润的程度则显著减轻；另LFB染色证实，LV-miR-873感染后的EAE小鼠髓鞘损伤严重，而LV-sponge感染后的EAE小鼠，其髓鞘损伤则明显减轻；电镜下，LV-miR-873感染后的EAE小鼠，其髓鞘出现断裂和崩解，而LV-sponge感染后的EAE小鼠，其髓鞘仅呈现轻微的松散状态。结论：小鼠EAE模型发病后，其脑组织中的miR-873、IL-17、IL-6、TNF-α及MIP-2、MCP-1/5因子以及p-NF-B/p65的表达均呈显著上调，但A20的表达则明显下调；另体内过表达miR-873能促进EAE小鼠前述炎症和趋化因子及p-NF-B/p65的生成，但A20蛋白的表达则明显下调；除此之外，过表达miR-873后，EAE小鼠脊髓的炎性细胞浸润和髓鞘损伤明显加重。但沉默miR-873后，上述蛋白和组织病变均呈现出与过表达miR-873相反的结果。由此可见，miR-873可能是调控小鼠EAE炎性病变的关键分子。
【图文】：

miR-873调控IL-17诱导的小鼠星形胶质细胞产生炎症与趋化因子的机制研究,刘晓梅;2012年

图 1 体外培养的星形胶质细胞形态普通倒置显微镜下的细胞形态（A ×100；B ×400）；抗 GFAP 免疫细胞化学染色，GFAP 的表达定位于胞浆，呈棕黄色（C ×200）；抗 GFAP 免疫荧光染色与 DAPI 核染（D，E，F ×200）。IL-17 刺激星形胶质细胞后不同时间及不同剂量时，炎症因子（IL-6、TNF-α）和趋化因子（MIP-2、MCP-1/5 ）分泌水平的改变IL-17 刺激星形胶质细胞产生上述炎性因子和趋化因子时间曲线的确定IL-17 是 Th17 产生的标志性的细胞因子，同时作为促炎的细胞因子，可上些炎症基因的表达[25]。为了研究 IL-17 对星形胶质细胞产生某些炎性因子与因子的影响，我们体外给予培养的星形胶质细胞以 100 ng /ml 的 IL-17 刺激，不同时间（3h、6h、12h、24h 和 48h）细胞的总 RNA 和细胞上清，检查炎子 IL-6、TNF-α 及趋化因子 MIP-2、MCP-1/5 的 mRNA 丰度与蛋白的分泌。如图 2A 所示，与 DMEM 组相比，炎性因子 IL-6 和 TNF-α 的 mRNA 丰度

miR-873调控IL-17诱导的小鼠星形胶质细胞产生炎症与趋化因子的机制研究

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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392

【参考文献】