【摘要】：Toll样受体（TLRs）信号通路诱导的先天免疫反应是宿主抵抗沙门氏菌感染的第一道防线。沙门氏菌感染鸡后，正常状态下，鸡体内的TLRs信号传递会迅速激活，但是抗病鸡抵抗沙门氏菌和感病鸡不能抵抗沙门氏菌的确切机制目前并不清楚。本文首先在细胞水平上研究LPS刺激和肠炎沙门氏菌（SE）感染鸡细胞后TLRs家族基因的表达情况，然后在活体水平用SE对SPF鸡攻毒，研究参与防御SE的几个重要的TLRs基因的表达情况以及可能存在的TLRs基因调控和被调控的分子机制。全文共包括3个试验： 试验一：LPS刺激/沙门氏菌感染鸡单个核细胞中TLRs家族基因的表达变化规律。从20只30日龄SPF中分离外周血单个核细胞（PBMCs），设计LPS刺激、肠炎沙门氏菌感染诱导和对照组三个处理，研究诱导后1h、6h和24h不同时间点细胞中9个TLRs基因的表达变化，并用1×10~9～1×10~4CFU10倍剂量梯度稀释的SE感染鸡PBMCs6h，进一步验证不同剂量SE感染诱导对参与防御SE的三个重要的TLRs基因—TLR4、TLR2-1和TLR21表达的影响。结果表明：（1）LPS刺激和沙门氏菌感染均能上调7个TLRs基因的表达，包括TLR4、TLR21和TLR2-1等重要识别受体基因。（2）诱导后6h，LPS处理组中TLR4和TLR2基因的表达显著上调（P 0.05），表达量为对照组的2倍以上。而沙门氏菌感染组TLR4的表达与对照组相比显著下调（P 0.05），TLR21和TLR2的表达量则没有显著变化（P0.05）。（3）诱导后24h，，沙门氏菌感染组TLR21和TLR1-2上调表达的倍数显著高于LPS处理组（P 0.05）；而TLR4、TLR2(TLR2-1和TLR2-2)和TLR1-1等基因在LPS处理组上调程度显著高于沙门氏菌感染组（P 0.05）。（4）不同剂量的SE感染细胞后6h，TLR4、TLR21和TLR2-1的表达或显著下调（P 0.05）或表达差异不显著（P0.05）（1×10~9CFU的SE感染时TLR2-1的表达量除外），SE的感染剂量会影响表达下调的程度。感染剂量为0～1×106CFU时，增加沙门氏菌的剂量，TLRs基因表达抑制作用增强；而感染剂量为1×10~6～1×10~9CFU时，随SE感染剂量的增加，TLRs基因表达抑制作用减弱。 试验二：抗病组和感病组鸡中TLRs、炎症因子及TLRs负调控基因的表达差异。为了研究TLRs的表达与鸡对沙门氏菌的抗、感病机制的关系，用8.7×10~8CFU的SE对20只30日龄的SPF鸡进行攻毒，攻毒后5日内死亡的鸡定为感病组，存活了15日的鸡定为抗病组，两组鸡各6只，比较攻毒后0h、8h、16h、24h、3d、12d的载菌量及基因表达的差异。结果表明：（1）16h感病组血液中肠炎沙门氏菌的载菌量为1.1×107CFU，显著高于抗病组（P 0.05）。（2）16h抗病组鸡的体温42.6℃显著高于攻毒前0h的体温41.9℃（P 0.05），而感病鸡体温的增加没有达到显著（P0.05）；3d时感病鸡的体温41.1℃显著低于抗病鸡的体温42.3℃（P 0.05）。（3）感病组鸡体重自16h持续下降，而抗病组16h后体重增加；在3d时感病组体重212.7g显著低于抗病组体重252.9g（P 0.05）。（4）感病鸡白细胞中TLR4、TLR2-1和TLR21的表达量显著低于抗病组（P 0.05）。（5）IFN-β和促炎症因子IL-6的基因表达量在抗病鸡中显著高于感病组（P0.05）。（6）负调控基因ZNF493和TOLLIP仅在感病鸡中显著上调表达（P 0.05）。以上结果表明：TLRs基因的表达受到抑制导致炎症因子表达不足、载菌量增加、体重下降是感病组鸡死亡的主要原因。 试验三：表观遗传修饰对TLRs基因的表达调控。为深入研究感病鸡中SE感染后16h时TLRs的表达抑制是否与ZNF493依赖的表观调控相关，在细胞水平研究了甲基化酶和去乙酰化酶抑制剂对鸡单个核细胞TLRs的表达变化；并用重亚硫酸盐修饰后测序PCR（BSP）方法比较了感病组和抗病组鸡中TLR4、TLR21和TLR2-1基因启动子区域以及外显子区域的CpG岛的甲基化水平。结果表明：（1）在沙门氏菌感染的外周血单个核细胞中，甲基化酶抑制剂5-Aza-dc处理均可以显著增加TLR4的表达（P 0.05），5-Aza-dc和TrichostatinA都可以显著上调TLR21和TLR2-1的表达（P 0.05），但两者没有协同效应。（2）感病组鸡TLR4和TLR21启动子区域、TLR2-1的外显子CpG岛区域的甲基化程度显著高于抗病鸡（P 0.05）。结果表明：TLR4、TLR21和TLR2-1的表达受甲基化调控，感病鸡中TLR4、TLR21和TLR2-1的表达抑制可能由于过高的甲基化引起。 总体而言，本研究结果表明TLRs家族中TLR4、TLR21和TLR2-1是肠炎沙门氏菌感染的重要识别受体，鸡白细胞中TLR4、TLR21和TLR2-1的表达被抑制是导致沙门氏菌易感性增加、鸡死亡的主要原因，而ZNF493相关的表观修饰促使TLRs表达被抑制。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392
【参考文献】
相关期刊论文 前9条
1 徐宁;于振海;王志强;曲洪林;孙毅;刘蛟;;Toll样受体4及其负性调控因子Tollip在结肠炎大鼠肠黏膜中的表达[J];第二军医大学学报;2012年01期
2 肖宇宏,白云;TOLL样受体:天然免疫和获得性免疫的桥梁[J];局解手术学杂志;2005年01期
3 金伯泉;;NLR:固有免疫模式识别受体中的一个重要家族[J];现代免疫学;2006年03期
4 王秋生;;一例乌骨鸡鸡白痢沙门氏菌感染的诊治[J];畜禽业;2007年04期
5 王晓铄;俞英;;表观遗传对炎症的调控机制及其在奶牛乳房炎抗病育种中的应用前景[J];遗传;2010年07期
6 强文军;王莹;路茜;王忠;;β-1,3-葡聚糖对肠炎沙门氏菌感染鸡肠道氧化还原状态的影响[J];中国畜牧杂志;2010年23期
7 许金俊;王韵;陶建平;;育成鸡鸡白痢沙门氏菌病的诊断和防治[J];中国兽医杂志;2007年02期
8 赵德明,王彩虹;鸡肠炎沙门氏菌感染症[J];中国兽医杂志;1998年08期
9 汪进良;焦顺昌;胡毅;李瑾昱;;重组人p53腺病毒联合顺铂对肺腺癌A549细胞基因表达的影响[J];中国医学科学院学报;2010年04期
相关博士学位论文 前3条
1 赵保胜;桂枝汤等解表/清热方和相关成分对TLRs及其信号转导通路的影响[D];中国中医科学院;2007年
2 王丹丹;固有免疫系统在铜绿假单胞菌肺部感染中的作用[D];中国协和医科大学;2007年
3 吴正蓉;Cripto-1(CR-1)在鼻咽癌中的作用及其机制研究[D];南方医科大学;2009年
相关硕士学位论文 前3条
1 汪敏;肠炎沙门氏菌实验性感染雏鸡的研究[D];西南大学;2009年
2 李鹏;鸡白痢沙门氏菌致病性及MyD88-依赖途径信号分子表达的研究[D];河南农业大学;2009年
3 宋咏梅;鸡TLR4信号通路与肠炎沙门氏菌感染关系的研究[D];中国农业科学院;2010年
本文编号：
2523871
本文链接：https://www.wllwen.com/xiyixuelunwen/2523871.html
