重组Gax腺病毒对IGF-1干预大鼠脂肪细胞通道蛋白FAK，PYK2的影响

发布时间：2019-08-07 14:30

【摘要】：研究目的 脂肪组织不仅是储能组织,脂肪细胞分泌的细胞因子,与糖尿病,高血压,动脉粥样硬化,炎症反应密切相关,促进心血管疾病的发生和发展。胰岛素样生长因子-1(IGF-1)具有类胰岛素样作用,是生长因子促进因子,影响多种细胞的增殖,生长及分化。同样,IGF-1调控脂肪细胞的行为,影响脂肪细胞的细胞周期,在脂肪细胞增殖中作为必须的因子调控细胞周期G1期至S期。黏着斑激酶(FAK)调节多种细胞的生物学行为,与其家族成员一起作为细胞多条信号转导的枢纽发挥重要作用。尤其是它们中的PYK2是调节细胞活性的中心。IGF-Ⅰ能加快细胞移动、FAK磷酸化,并能激活PYK2调节细胞间的黏附。Gax基因具有抑制细胞迁移,增殖及促进细胞凋亡作用。Gax可干预细胞的周期,使有丝分裂的细胞停止于G1期,这与IGF-1作用相反。但目前关于Gax能否抑制IGF-1干预的脂肪细胞通道蛋白FAK, PYK2尚未有报道。本实验旨在对其进行阐述。 研究方法 1.将目的基因GAX从原始质粒上切下,与腺病毒载体重组,获得重组腺病毒质粒,鉴定正确后,纯化扩增腺病毒。 2.细胞培养用3-4代3T3-L1前脂肪细胞培养,直到接触抑制后2天后用地塞米松,IBMX及胰岛素等培养脂肪细胞,11天左右脂肪细胞出现大量脂滴。用油红O染色鉴定90%以上脂肪细胞出现脂滴,符合实验要求。 3.实验分组 (1)按是否含Gax病毒分组：用含Gax的腺病毒转染脂肪细胞,分为空白对照组,Ad-GFP组,Ad-Gax组,干预时间为48h。 (2)按IGF-1的干预及Gax腺病毒的转染分组：分为空白对照组,Ad-GFP组,Ad-Gax组,IGF-1+Ad-Gax组,Ad-GFP+IGF-1组,各组干预时间均为48h。 4.蛋白免疫印记技术按是否含Gax病毒分组,观察48h后脂肪细胞Gax的蛋白表达情况。按IGF-1和Gax转染分组,观察各组48h后脂肪细胞FAK, PYK2的蛋白表达情况。 5.实时定量多聚酶链反应检测IGF-1及Gax干预48h后脂肪细胞FAK, PYK2的mRNA相对表达。 结果 1.经琼脂糖凝胶电泳鉴定证实Gax基因成功插入到目的载体上,获得重组腺病毒。 2.脂肪细胞鉴定：用第3-4代3T3-L1前体脂肪细胞接触抑制2天后诱导分化,第5天左右出现脂滴,第11天左右90%脂肪细胞出现脂滴,经油红O染色证实为脂肪细胞,用于实验。 3.病毒转染：重组Gax腺病毒转染脂肪细胞,48h后行倒置荧光显微镜观察,90%脂肪细胞出现绿色荧光。 4.蛋白表达：病毒转染脂肪细胞48h后,Ad-Gax组与空白对照组,Ad-GFP组相比较,Gax蛋白表达明显上调(p0.01),Ad-GFP与空白对照组比较差异没有统计学意义(p0.05)。IGF-1及病毒干预脂肪细胞48h后,Ad-GFP+IGF-1组FAK, PYK2较空白对照组,Ad-GFP组,Ad-Gax组,Ad-Gax+IGF-1组比较蛋白表达水平显著增加(p0.01), Ad-Gax组与Ad-Gax+IGF-1组FAK, PYK2较空白对照组,Ad-GFP组,Ad-GFP+IGF-1组比较蛋白表达水平显著减少(p0.01),差异有统计学意义。Ad-GFP组较空白对照组比较差异无统计学意义(p0.05)。 5. mRNA表达：IGF-1及腺病毒干预脂肪细胞48h后,Ad-GFP+IGF-1组FAK, PYK2的mnRNA相对表达较空白对照组,Ad-GFP组, Ad-Gax组,Ad-Gax+IGF-1组显著增加(p0.01),Ad-Gax组与Ad-Gax+IGF-1组FAK, PYK2的mRNA相对表达较空白对照组,Ad-GFP组,Ad-GFP+IGF-1组比较显著减少(p0.01),差异有统计学意义。Ad-GFP组较空白对照组差异无统计学意义(p0.05)。 结论 1.大鼠Gax基因能有效转染脂肪细胞,并且在脂肪细胞中表达。 2.Gax能有效抑制IGF-1对脂肪细胞的干预作用。 3.IGF-1能激活FAK, PYK2信号转导通路转导,刺激FAK, PYK2的mRNA及蛋白表达,而Gax能有效对抗IGF-1的刺激作用,抑制FAK, PYK2信号转导通路。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

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本文编号：2524018