粉尘螨变应原Der f 2在毕氏酵母中表达及圆二色谱分析

发布时间：2019-08-07 15:16

【摘要】：目的克隆粉尘螨变应原Der f 2编码基因,并构建毕氏酵母表达体系,对表达产物进行圆二色分析。方法提取粉尘螨总RNA,根据GenBank中的序列设计并合成简并引物,PT-PCR扩增Der f 2全长基因,与pGAPZα-A载体连接后转化至E.coli Top10F',取阳性克隆并测序;将pGAPZα-A-Der f 2用BlnⅠ进行线性化,电转化至GS115感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,采用SDS-PAGE验证表达产物,用His Trap HP亲和柱纯化重组蛋白Der f 2,进行圆二色谱扫描分析。结果 PCR扩增获得Der f 2编码基因,成功构建表达质粒pGAPZα-A-Der f 2,SDS-PAGE验证表明该质粒在GS115感受态细胞中正常表达,表达产物分子质量单位为14.9ku,重组蛋白Der f 2纯化后进行圆二色谱数据分析,其二级结构α-螺旋占41.2%,转角占10.3%,β-折叠占26.8%,不规则卷曲占21.7%。结论尘螨变应原Der f2在毕氏酵母中成功表达,为该变应原的进一步研究及规模生产和应用奠定了基础。
【图文】：

鉴定ＭＤＬ２０００ＤＮＡｍａｒｋｅｒ１ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＤｅｒｆ２ｇｅｎｅＦｉｇ．１ＴｈｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｂｙａｇａｒｏｓｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（１．０％）２毕氏酵母表达质粒ｐＧＡＰＺα－Ａ－Ｄｅｒｆ２构建和酶切鉴定以ｐＧＡＰＺα－Ａ－Ｄｅｒｆ２为模板，ＰＣＲ扩增目的基因，经１％琼脂糖凝胶电泳后回收产物并与ｐＧＡＰＺα－Ａ载体连接成为ｐＧＡＰＺα－Ａ－Ｄｅｒｆ２，经ＸｈｏＩ和ＸｂａＩ双酶切鉴定毕氏酵母表达质粒构建成功（图２）。将筛选的阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司测序，结果与预期一致。３工程菌ｐＧＡＰＺα－Ａ－Ｄｅｒｆ２／ＧＳ１１５的构建、筛癣表达及重组蛋白纯化和浓缩用ＢｌｎⅠ对鉴定正确的重组质粒进行线性化，然后电转化毕赤酵母ＧＳ１１５感受态细胞，用菌落ＰＣＲ筛选阳性克拢分别挑取３个阳性酵母单菌落于含有１００ｍｇ／ＬＺｅｏｃｉｎ的ＹＰＤ液体培养基中，３００ｒ／ｍｉｎ、３０℃培养，每隔４８ｈ取１ｍｌ发酵菌液样品１ｍｌ，离心取上清，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定表达产物约１４．９ｋｕ（图３），与预期一致。取发酵菌液１．５Ｌ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｈ，取上清，，调节ｐＨ至７．４。用ＨｉｓＴｒａｐＨＰ亲和柱纯化的重组蛋白，确定纯化重组蛋白咪唑洗脱液最佳浓度为１００ｍｍｏｌ／Ｌ（图４）。Ｍ１ＤＮＡ标志物（ＤＬ２０００）Ｍ２ＤＮＡ标志物（ＤＬ１５０００）１ＸｈｏⅠ和ＸｂａⅠ双酶切图２质粒ｐＧＡＰＺα－Ａ－Ｄｅｒｆ２的ＸｈｏⅠ和

ｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅＸｈｏⅠａｎｄＸｂａⅠＭ蛋白分子质量标准２４重组质粒转化菌表达产物图３Ｄｅｒｆ２毕赤酵母表达产物ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析ＭＰｒｏｔｅｉｎＭＷｍａｒｋｅｒ（Ｂｒｏａｄ）２－４Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｄｅｒｒｆ２ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎＦｉｇ．３ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＤｅｒｆ２Ｍ蛋白分子质量标准１ＨｉｓＴｒａｐＨＰ亲和柱纯化的重组蛋白图４Ｄｅｒｆ２毕赤酵母表达产物纯化后ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析ＭＰｒｏｔｅｉｎＭＷｍａｒｋｅｒ（Ｂｒｏａｄ）１Ｄｅｒｒｆ２ｐｕｒｉｆｉｅｄｒｅｃｏｍｂｉ－ｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎＦｉｇ．４ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄｐｒｏｄｕｃｔｏｆＤｅｒｆ２·５４７·中国病原生物学杂志ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｇｅｎＢｉｏｌｏｇｙ２０１７年６月第１２卷第６期Ｊｕｎｅ２０１７，Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．６
【作者单位】： 盐城卫生职业技术学院;东南大学医学院附属盐城医院中心实验室;
【基金】：国家自然科学基金项目(No.NSFC31272369,NSFC81001330,NSFC 30060166,NSFC31572319) 江苏省卫生厅招标项目(No.Z200914) 盐城市医学科技发展计划项目(YK2014047)
【分类号】：R384.4

【相似文献】

相关期刊论文 前3条

1 袁新彦,李朝品,许礼发;粉尘螨变应原明胶微球口服免疫动物的脱敏效果[J];中国寄生虫病防治杂志;2004年02期

2 赵丹;崔玉宝;彭江龙;周鹰;王颖;孙炜;;粉尘螨变应原第7组分全长基因序列测定与分析[J];现代生物医学进展;2009年16期

3 ;[J];;年期

相关会议论文 前1条

1 黄夏飞;李靖;张罗;林小平;;屋尘螨和粉尘螨变应原皮肤点刺液诊断IgE介导螨过敏症的敏感性与特异性的多中心研究[A];中华医学会2011年全国变态反应学术会议论文集[C];2011年

本文编号：2524029