生殖支原体MG427重组蛋白的表达、纯化及抗氧化功能的初步研究

发布时间：2019-08-07 17:34

【摘要】：目的:表达生殖支原体(Mycoplasma genitalium, Mg)MG427重组蛋白, 并研究其是否具有过氧化物酶活性,以进一步探索Mg在宿主内持续感染的可能机制。 方法:通过登录GenBank获取Mg的mg427基因序列,用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物,以Mg标准株G37 DNA为模板进行聚合酶链式反应(PCR)扩增mg427基因;经双酶切后将mg427克隆入原核表达载体pGEX-6p-1以构建重组质粒pGEX-6p-1/mg427;经测序鉴定后,定点诱导该基因中第289～291位核苷酸TGA密码子突变为TGG;将突变后的重组质粒转化入E.coli BL21,并用IPTG诱导表达重组蛋白MG427,SDS-PAGE和Western blotting分析和鉴定表达结果,GST亲和层析柱纯化重组蛋白,采用PreScission Protease将重组蛋白GST标签切除后经Millipore Amicon Ultra-4离心超滤浓缩,用BCA法测定表达的重组蛋白浓度;将纯化的MG427蛋白进行氧化铁二甲酚橙实验(FOX)、DTT氧化实验以探讨其酶活性。 结果:PCR扩增出约426 bp的目的基因;构建的重组质粒经PCR、双酶切和测序鉴定其中插入的目的基因序列,经BLAST比对与GenBank上登录的Mg-G37的mg427基因序列完全一致。通过PCR介导的定点突变,mg427中的TGA被成功突变为TGG。经SDS-PAGE分析,在IPTG诱导下,在表达菌中表达出相对分子量(Mr)约为41.1 KDa的重组目的蛋白,该目的蛋白在菌体细胞内主要以可溶性形式存在。用GST亲和层析柱成功纯化出该重组蛋白,Westernblotting结果表明表达的重组蛋白为GST融合蛋白。采用PreScission Protease成功将重组蛋白(rMG427)上GST标签切除。FOX实验的结果表明:MG427具有过氧化物酶活性,能在一定程度上降解H_2O_2,且不同浓度的MG427降解H_2O_2的速度不同;DTT氧化实验结果表明MG427蛋白中含有半胱氨酸,可能通过形成二硫键参与过氧化物代谢。 结论: 1、成功构建了pGEX-6p-1/MG427的原核表达载体,并在E.coli中表达出Mr约为41.1 KDa的可溶性重组蛋白; 2、MG427具有过氧化氢酶活性,其半胱氨酸残基可能参与过氧化物代谢;
【图文】：

1 琼脂糖电泳分析 mg427 PCR 扩增结果1 Amplification of mg427 gene of M. genirker ; 2-3 : PCR product of mg427gene；427 重组质粒的鉴定X-6p-1/MG427 质粒为模板行 PCR 经 BamHⅠ和 NotⅠ双酶切，结果出现了两个片段，大片段接近 5 0，初步证明 mg427 目的基因成功地生工进行 DNA 序列测定，，验证插的 Mg G37 的 mg427 序列进行 blast

重组质粒 pGEX-6p-1/MG427 的酶切ication of recombinant plasmid pGEX-6igested by BamHⅠand NotⅠ.； 2: pbp DNA Marker; 4: PCR product of p点突变技术，将mg427中289~291位核变后 PCR 结果显示约 426bp 处有1 2 3 4 5
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R346

【共引文献】

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本文编号：2524089