GABA信号在围植入期小鼠子宫中的表达及功能研究

发布时间：2019-08-09 12:58

【摘要】：目的：哺乳动物胚胎植入是妊娠成功的关键环节之一。小鼠胚胎植入及胎盘形成的的主要步骤包括：胚泡滋养外胚层粘附于子宫内膜腔上皮；滋养层增殖进而穿过腔上皮；围绕胚泡粘附周围的子宫内膜基质细胞增殖分化为蜕膜细胞；滋养层分化并具备侵袭表型，穿过子宫蜕膜组织，进入母体血管；最后形成功能性的胎盘。在这一过程中，子宫内膜蜕膜化及滋养层对蜕膜组织的适度侵袭对妊娠的建立和维持至关重要，因此也成为研究热点。最初作为抑制性神经递质展开研究的γ-氨基丁酸，它的主要功能在于传递抑制性的神经信号，具有镇静、催眠、抗惊厥、降血压的生理作用，现已被开发合成口服制剂，用于医药卫生、农业等，且表现出一定的生产价值。γ-氨基丁酸可作为胃肠肽，促进胃液和生长激素的分泌，兴奋动物的采食中枢，从而增加采食量；同时还可以减少动物的无意识运动，以减少能量消耗，从而达到促生长的目的。近年来，关于γ-氨基丁酸在外周组织中的调节作用备受关注，尤其是在热点问题之一肿瘤的研究中。γ-氨基丁酸及其受体特异性表达于外周多种内分泌组织和器官肿瘤，并表现出调节肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力。而在生殖领域的研究中，早期的研究报道了，γ-氨基丁酸的A型受体π亚基扮演着重要角色。孕激素及其代谢中间物四氢孕酮能通过π亚基抑制子宫平滑肌的收缩,维持足月妊娠。在大鼠, π亚基在分娩启动前一直保持高水平,而在D19.5日和分娩过程中含量急剧下降,导致子宫对四氢孕酮的敏感性减弱,从而解除四氢孕酮对子宫静息状态的维持,促使分娩的启动。在本实验室的前期研究中发现，在小鼠胚胎植入前期（D1-D4），GABA及其A受体π亚基，B受体B1亚基均动态表达于子宫腔、腺上皮，并参与了囊胚脱带及外延生长，提示其参与植入前的母体-胚胎对话。在本实验中，我们研究了GABA信号在小鼠子宫D5-D8中的表达，并探讨了GABA信号对蜕膜化进程的影响及在早期滋养层侵袭中的作用。该研究将为阐明哺乳动物胚胎着床的分子机制补充新的依据，同时为中枢神经递质在生殖领域的研究提供新的视野。第一部分GABA信号在围植入期小鼠子宫的表达目的：检测GABA、GABRP及GB1在围植入期小鼠子宫的含量及动态变化。方法：提取总RNA，两步法RT-PCR检测妊娠小鼠D4-D8子宫中GABRP及GB1mRNA水平的表达；制作石蜡切片，采用免疫组化检测妊娠小鼠D4-D8子宫中GABA、GABRP及GB1蛋白的表达；提取总蛋白，采用western blot检测妊娠小鼠D4-D8子宫中GABRP及GB1蛋白水平的表达；比色法检测妊娠小鼠D1-D8子宫中的GABA含量。结果：GABRP及GB1mRNA表达于D4-D8小鼠子宫。与D4比较，GABRPmRNA的表达水平在D5及D7植入位点处上升（P0.05），而在非植入位点之间表达水平无统计学差异（P＞0.05）。GABRP mRNA的表达水平在D6及D8非植入位点处显著高于对应的植入位点（P0.05）。在各植入位点中，与D4比较，GB1mRNA的表达水平仅在D5时表达升高（P0.05）。免疫组化结果显示， GABA、GABRP及GB1均表达于细胞胞质。在D4，GABA、GABRP及GB1表达于小鼠子宫的腔、腺上皮，而GABA、GABRP还表达于基质细胞。在D5，GABA、GABRP及GB1表达于小鼠子宫残留的腔、腺上皮。在D6-D8，GABA、GABRP及GB1则逐渐出现在初级蜕膜带及次级蜕膜带的蜕膜细胞，且GB1还弱表达于D8的EPCs。Western blot结果显示，GABRP及GB1蛋白表达于D4-D8小鼠子宫。在D4-D8中，GABRP蛋白在D5子宫的植入位点及非植入位点处表达均达最高峰，与D4比较，差异均具有极显著性(P0.01)，但随后呈现下降趋势。GABRP蛋白在各非植入位点之间的表达水平与对应植入位点之间无显著差异。GB1蛋白在D7子宫的植入位点与非植入位点处表达均达最高峰，植入位点与D4比较，非植入位点与D5非植入位点比较，差异均具有显著性(P 0.05)。比色法结果显示，在植入早期（D1-D4），与D1比较，GABA含量D3时出现上调（P＜0.05），而在D4时出现下降趋势。在植入期（D5-D8），GABA含量在D5植入位点处呈现出最大值，与D4比较，差异具有极显著性（P＜0.01），随后继续出现下降趋势，且在D6-D8的非植入位点含量显著高于对应的植入位点处，差异具有极显著性（P＜0.01）。结论：GABRP及GB1mRNA及蛋白动态表达于围植入期的小鼠子宫；GABA含量在围植入期的小鼠子宫中呈现动态变化趋势；GABA及GABRP主要定位于围植入期D4-D8的小鼠子宫基质细胞及蜕膜区域的蜕膜细胞；GB1主要定位于D6-D8的蜕膜区及D8的绒毛膜锥部位。第二部分GABA信号在小鼠子宫蜕膜化进程的功能研究第一节GABA信号在小鼠子宫基质细胞体外蜕膜化进程的功能研究目的：成功建立小鼠子宫基质细胞体外人工诱导蜕膜化模型；检测在蜕膜化过程中，GBARP及GB1mRNA和蛋白表达水平的变化；研究GABA及其A受体对蜕膜化过程中细胞增殖、周期及凋亡情况的影响；研究细胞周期蛋白cyclinD3是否参与GABA及其A受体对蜕膜化过程的调节。方法：原代提取小鼠子宫基质细胞，用抗基质细胞标志物vimentin及上皮细胞标志物cytokeratin抗体，鉴定基质细胞纯度并采用间接免疫荧光方法检测GABA、GABRP在基质细胞中的表达；采用E2联合P4方法诱导基质细胞发生蜕膜化，并选取0h，24h，48h及72h4个时间点，采用western blot检测蜕膜化标志物PRL的表达，以鉴定蜕膜化体外模型是否建立成功；提取总RNA，两步法RT-PCR检测GABRP及GB1在0h，24h，48h及72h4个时间点的mRNA表达水平变化；提取总蛋白，western blot检测GABRP在0h，24h，48h及72h4个时间点的蛋白表达水平变化；在诱导基质细胞蜕膜化反应的同时，分别加入GABA(1μM,10μM及100μM); GABA A受体激动剂Muscimol (0.5μM,5μM及50μM);最佳作用浓度的GABA与不同浓度的GABAA受体拮抗剂S106(0.5μM,5μM及50μM)联合处理，分别于处理后24h，48h，72h，采用MTS和流式细胞术检测基质细胞增殖，周期分布及凋亡情况，western blot检测细胞cyclinD3的表达变化情况。结果：本研究提取的小鼠子宫基质细胞，经鉴定，细胞纯度达95%以上，可用于后续实验；Western blot结果显示，与0h比较，PRL蛋白表达水平随着诱导时间的延长，表达水平上调，其差异极有显著性（P＜0.01），提示成功诱导小鼠基质细胞蜕膜化。RT-PCR结果显示，与0h比较，GABRP的mRNA表达水平随着诱导时间的延长表达下调，其差异有显著性（P＜0.05）；间接免疫荧光结果显示，GABA、GABRP蛋白主要定位于原代提取的基质细胞的胞质；western blot结果显示，与0h比较，GABRP的蛋白表达水平随着诱导时间的延长表达下调，其差异有显著性（P＜0.05）。MTS结果显示，在诱导基质细胞蜕膜化的48h及72h时，1μM GABA和5μM GABAAR激动剂Muscimol显著抑制细胞增殖（P0.05），而50μM S106能成功逆转1μM GABA对细胞增殖的抑制作用；流式细胞术结果显示，在48h时，1μM GABA及5μM Muscimol能显著增加S期的细胞分布数量（P0.05），而50μMS106成功逆转1μM GABA对细胞S期的影响；流式细胞术结果显示，在72h时，1μM GABA及5μM Muscimol能显著增加细胞的凋亡数量（P0.05）；而50μM S106成功逆转1μM GABA对细胞凋亡的影响；western blot结果显示，与空白对照比较，在诱导基质细胞蜕膜化的48h及72h时，1μM GABA及5μM Muscimol处理能显著降低cyclinD3的表达（P0.05），而50μM S106成功逆转1μM GABA对cyclinD3表达的下调作用。结论：体外成功诱导小鼠子宫基质细胞蜕膜化反应；GABA及GABRP主要定位在基质细胞胞质，并随着蜕膜化进程，GABRP的mRNA及蛋白表达水平均呈现下降趋势。GABA可能通过GABA A受体抑制体外基质细胞增殖，促进细胞凋亡，扰乱细胞周期分布，从而体外抑制蜕膜化过程，并且cyclinD3参与调节该行为。第二节GABA在小鼠子宫体内蜕膜化进程的功能研究目的：探讨GABA对于小鼠子宫体内蜕膜化进程的影响。方法：于D5开始，分别腹腔注射0.05g/kg，0.5g/kg及5g/kg的GABA，每日1次，连续注射3日；于D8时处死小鼠，取出子宫，统计蜕膜鼓包的个数及称重；随后固定各处理组的蜕膜鼓包，进行石蜡切片，随后行HE染色，采用Image J软件计算大核及多核的面积；采用western blot检测蜕膜化标志物PRL在各组D8子宫植入位点处的表达。结果：与空白对照组比较，0.05g/kg及5g/kgGABA组可显著减少蜕膜鼓包的数量（P＜0.05），同时，0.5g/kgGABA可减轻蜕膜鼓包重量（P＜0.05）；通过ImageJ软件计算面积可知，与空白组比较，0.05g/kg及0.5g/kgGABA显著降低大核多核区域面积（P＜0.05）；western blot结果显示，与空白对照组比较，各浓度组的GABA均能显著降低PRL的表达量，其差异具有显著性（P＜0.05）。结论：GABA可能通过减少蜕膜化的面积及降低蜕膜化反应的强度，从而在体内抑制小鼠子宫蜕膜化进程。第三部分GABA信号在小鼠早期滋养层侵袭中的功能初探目的：研究GABA及其B受体对蜕膜细胞侵袭能力及绒毛膜锥(ectoplacental cones, EPCs)外延生长能力的影响。方法：原代分离D8小鼠子宫蜕膜细胞，间接免疫荧光检测GABA及GB1的表达；采用GABA(1μM,10μM及100μM); Baclofen(0.5μM,5μM及50μM；最佳作用浓度的GABA分别与2-Hydroxysaclofen(0.2μM,2μM及20μM)干预蜕膜细胞，transwell小室模型检测蜕膜细胞侵袭能力的变化；原代分离EPCs，种于Matrigel胶上，采用采用GABA(1μM,10μM及100μM); Baclofen(0.5μM,5μM及50μM；最佳作用浓度的GABA分别与2-Hydroxysaclofen(0.2μM,2μM及20μM)干预，分别于24h，48h，72h观察EPCs粘附及外延生长情况，采用Image J软件分析EPCs外延生长能力的变化。结果：间接免疫荧光结果显示，GABA及GB1表达于原代蜕膜细胞胞质；采用transwell小室模型，计算下室细胞数量，统计分析可知，100μM GABA，5μM Baclofen减少下室细胞数量，提示其抑制蜕膜细胞的侵袭能力，，而20μM2-Hydroxysaclofen可逆转100μM GABA对细胞侵袭的抑制作用；显微镜下观察，不同处理组的EPCs均有90%以上的黏附率，其差无异显著性，通过Image J软件分析可知，在处理后的24h及48h时，100μM GABA及5μM Baclofen均可促进EPCs的外延生长(P 0.05)，而20μM2-Hydroxysaclofen可逆转100μM GABA对EPCs外延生长的促进作用。结论：GABA可能通过B受体促进EPCs的外延生长，从而表现为促进滋养层侵袭至母体蜕膜组织；然而却表现为抑制该过程中的蜕膜细胞的侵袭能力。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R321

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