以ASP-1为佐剂研制H5N1病毒新型疫苗的试验研究

发布时间：2019-08-10 07:18

【摘要】：目的：本研究旨在以ASP-1重组蛋白作为一种新型生物佐剂,利用其佐剂活性进行H5N1病毒新型疫苗研究,发展具有良好免疫原性和免疫保护效果的H5N1病毒新型疫苗。方法：本研究首先在生物信息学分析的基础上,设计ASP-1截短片段,利用原核系统表达,获得作为佐剂的ASP-1重组蛋白,研制了两种H5N1病毒重组疫苗,一是参照H5N1病毒A/Vietnam/1194/2004株HA抗原序列,经密码子优化后,利用昆虫杆状病毒系统进行HA重组抗原的表达与纯化。将获得的ASP-1重组蛋白作为佐剂或使用常规氢氧化铝佐剂制备HA重组疫苗,免疫BALB/c小鼠后对疫苗的免疫原性和免疫保护效果进行检测和评价。二是通过对H5N1病毒M2蛋白进行保守性分析,获得M2蛋白胞外区(M2e)共有序列。以此为靶抗原分子,设计由pET32a载体蛋白trxA与3个串联的M2e分子融合表达的疫苗分子,利用原核表达系统进行融合蛋白的重组表达与纯化,并将纯化后的重组蛋白命名为TrxA-M2e3。以ASP-1重组蛋白作为佐剂免疫BALB/c小鼠,检测重组疫苗免疫原性并通过攻毒保护性试验评价疫苗对不同进化分支H5N1病毒的交叉保护效果。结果结论：本研究成功实现了ASP-1佐剂蛋白、HA重组抗原和TrxA-M2e3重组蛋白的表达。以重组表达的ASP-1蛋白作为佐剂,低剂量的HA重组疫苗可以诱导高滴度的抗原特异性抗体,并可使免疫小鼠在致死剂量H5N1病毒攻击时获得完全免疫保护。重组表达的TrxA-M2e3蛋白应用ASP-1佐剂免疫小鼠同样可以诱导高滴度抗体,并可有效发挥针对不同进化分支H5N1病毒的交叉保护作用。应用ASP-1作为佐剂进行的疫苗免疫结果表明ASP-1重组蛋白具有良好的佐剂活性,有效增强疫苗的免疫原性,并且可产生Th1偏移的免疫反应。这些研究结果表明,截短表达的ASP-1重组蛋白可作为一种良好的新型佐剂应用于发展H5N1病毒新型疫苗。以诱导中和抗体的HA抗原和高度保守的M2e分子为靶抗原,结合ASP-1蛋白佐剂活性可以发展出具有良好免疫原性和免疫保护效果的H5N1病毒新型疫苗。
【图文】：

蛋白抗原,抗原表位,氨基酸残基,蛋白A

2佐剂蛋白ASP一1的设计与制备2.3实验结果23.1ASP一1蛋白抗原表位预测利用恤p://tools.immuneepitope.o嗯/t0015/beell/iedb--input网站提供的抗原表位在线分析软件对ASP一1抗原表位区进行预测。将预测出的表位区按评分大小排列，结果显示第16一22位氨基酸残基的抗原表位得分最高(图1)。提示ASP一1全长蛋白前22位氨基酸残基含有抗原优势表位。致致巴吮巍巍怒蟋巍滋政橄匆..日..口暇噢翻圈...

截短,表达质粒,片段,T载体

2.3.3表达质粒pQE30一ASP一1的构建及鉴定根据实验所设计的引物PCR扩增ASP一 167一660bp位碱基的截短片段，命名为AsP一1。如图3A所示，，PcR扩增出与预期大小相符合(大小约为594bp)的目的片段。T载体与截短的ASP一1基因连接，构建重组质粒，命名为pMD18一Ts一ASP一1。用BamHI、Hindlll双酶切AsP一1基因并克隆至pQE30表达载体，构建重组表达质粒pQE30一ASP一1。经BamHI、Hindlll双酶切鉴定(图3B)和DNA测序鉴定，证实截短表达ASP一1重组蛋白的重组表达质粒pQE3O一ASP一1构建成功。
【学位授予单位】：江西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392

【参考文献】