利用噬菌体展示技术发现针对血型抗原的单链抗体

发布时间：2019-09-12 01:36

【摘要】：以肿瘤靶向治疗为目标,单链抗体为研究对象,红细胞膜为例,构建利用噬菌体展示技术发现针对肿瘤细胞表面抗原的特异性单链抗体的方法。第一步为构建人源噬菌体单链抗体库,第二步为利用红细胞膜为抗原,进行噬菌体单链抗体库的淘洗,筛选能特异结合红细胞膜的单链抗体。单链抗体由以一段弹性连接链(Linker)相连的抗体重链可变区基因(VH)与轻链可变区基因(VL)组成。为获取VH和VL基因,首先利用淋巴细胞分离液分离健康人O型外周血中的淋巴细胞,提取RNA再反转录为cDNA,以此作为PCR扩增抗体可变区基因的模板；设计用于扩增VH和VL基因的引物共31条,并在引物中设计了酶切位点便于进行克隆和鉴定。通过75个引物相互配对的PCR反应,扩增获得了包含个体基本所有的重链可变区和轻链可变区基因。设计单链抗体以VH-Linker-VL构型与噬菌粒载体pFAB相连,Linker序列为易折叠的(GGGGS)3序列。在构建pFAB-VH-Linker-VL重组质粒的基础上,通过添加新酶切位点和移码突变构建pFAB-BXM重组质粒,以此为载体,将之前扩增的VH基因和VL基因分别插入其中,构建重链抗体库和轻链抗体库。最后,通过PCR扩增出重链抗体库中VH片段,插入轻链抗体库中,获得库容量约为4×106人源噬菌体单链抗体库。在完成构建人源噬菌体单链抗体库的基础上,利用红细胞膜为抗原,筛选特异性结合细胞膜表面抗原的单链抗体。首先,利用抗A、B血型定型试剂对包被后的红细胞膜的抗原活性进行检测,确定经低渗及超声处理后的红细胞膜有血型抗原的活性且成功包被于ELISA板上。在筛选前对洗涤条件进行摸索,首先检测不同浓度Tween洗涤对红细胞膜活性的影响,发现0.1%及以下浓度PBST (PBS+0.1%Tween)对红细胞膜抗原活性无影响。然后,摸索淘洗噬菌体单链抗体库的洗涤条件,发现Tween洗涤能力过强,造成一些可能是特异性结合、但亲和力低的单链抗体噬菌体被洗脱,故淘洗时用没有Tween的PBS洗涤即可。最后,将A、B两种红细胞膜分别包被于ELISA板上,经1%BSA封闭后,第一轮加入1011噬菌体,第二轮加入1010,第三、四轮加入108,第五、六轮加入107,经PBS洗涤10遍后,利用0.2M Gly-HCl(pH2.2)洗脱,再侵染大肠杆菌XL1-Blue,获得能结合红细胞膜抗原的单链抗体噬菌体。经六轮淘洗,结合A、B红细胞膜的噬菌体均有所富集,并筛选出一些亲和力比较高的噬菌体。
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392

【参考文献】