MS2噬菌体的纯化和残留核酸的去除研究

发布时间：2019-09-12 05:50

【摘要】：目的:用三种方法将MS2噬菌体生产过程中产生的大肠杆菌的核酸、细胞器、细胞碎片、化学试剂等去除掉,纯化MS2噬菌体,同时比较三种纯化方法的优劣;分别用四种方法去除MS2噬菌体中混有的大量核酸,使MS2噬菌体达到内参照品的要求,同时比较四种方法的优劣。 方法:含有大量杂质的MS2噬菌体用三种方法进行纯化,超速离心法、三氯甲烷抽提法、分子筛法,比较三种方法的优劣性;分别应用酶消化法、无限稀释和透析综合法、超速离心法、Millipore柱子法四种方法去除MS2噬菌体中混有的大量核酸。 结果:用三种不同的方法纯化MS2噬菌体。超速离心法:电泳分析图可见,处理后的样本电泳条带亮度高,但有拖尾现象,且通过电镜分析可知,背景纯度不高,且含有大量的杂质。三氯甲烷法:电泳分析图可见,处理后的样本电泳条带亮度高,无拖尾现象,且通过电镜分析可知,背景纯度高,不含有杂质,但通过SDS-PAGE分析图可见样本中却有少量的杂蛋白残留。分子筛法:通过SDS-PAGE分析图可知,处理后的样本无杂蛋白残留,只含有14KD的MS2噬菌体单体。 用四种不同的方法去除MS2噬菌体中混有的大量核酸。酶消化法:通过柱状分析图可知应用50U、25U、12.5U、2.5U的酶浓度,其CT值相差不多,也就是说DNA模板量相差不多。无限稀释和透析综合法:通过PCR分析图得知,随着稀释度的增加,透析前后的样本之间只有些微的差异,且通过电泳分析也可得知,随着稀释度从10-2至10-7的增加,电泳条带亮度相差不多,且透析前后的电泳条带亮度也相差不多,加核酸酶与不加核酸酶处理的电泳条带亮度也是相差不多,通过电镜观察可知,透析后的MS2噬菌体中混有大量的化学试剂的结晶,掩盖了大量的MS2噬菌体。超速离心法:通过PCR产物电泳图可知,第七次离心后沉淀中残留的DNA于25个循环时才出现,且消化掉DNA的影响后,RNA既MS2噬菌体的量仍较大。然而通过Real Time PCR精确定量后,每一次离心后沉淀和上清中的噬菌体和残留核酸的量相差不多,且每离心一次大约损失10倍的噬菌体。Millipore柱子法:通过PCR产物电泳图可知,PBS Buffer组和Bezonase Buffer组在25个循环时才有少量的DNA模板进行扩增,Bezonase Buffer组的电泳条带亮度较PBS Buffer组亮度高,且通过RT-PCR检测,PBS Buffer组MS2噬菌体与残留核酸之间的绝对定量相差4个数量级,而Bezonase Buffer组MS2噬菌体与残留核酸之间的绝对定量只相差3个数量级,然而通过电镜观察,Bezonase Buffer组的样本背景较纯,而PBS Buffer组的样本背景跟前者相比较差,但两者都较未过Millipore柱子的样本背景纯度高。 结论:用三种不同的方法纯化MS2噬菌体,三氯甲烷抽提的方法最好;用四种不同的方法去除残留的核酸,过Millipore柱子法最好。
【图文】：

图一 酶切后电泳分析图2 去除 MS2 噬菌体中混有的核酸2.1 酶浓度法四种不同酶浓度 50U，25U，12.5U，2.5UPCR 检测其 CT 值，通过下图可知，各个量相差不多，应用高浓度的酶浓度消化掉种方式不能完全去除 DNA 残留。核酸酶处理后EV71 P-F25303540TCalveu

26图十一 上清中的绝对定量分析图2.4 Millipore 柱子法通过图十二可知，在 25 个循环时才出现电泳条带，既有的 DNA 模板进行扩Bezonase Buffer 组的电泳条带亮度较 PBS 组亮度高，说明 Bezonase Buffer 组的
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R378

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本文编号：2534925