【摘要】：目的:动脉粥样硬化(AS)是威胁人类健康的主要疾病之一,对于AS发病机制一直是心血管疾病研究的热点。其中血管平滑肌细胞(VSMC)由中膜层向内膜下间隙迁移并导致异常增生是动脉粥样硬化等心血管疾病发生发展的一个重要环节。PDGF作为一种强有力的体外趋化剂,可以诱导VSMC增殖和迁移。ROCK是Rho下游靶效应分子,分ROCKⅠ和ROCKⅡ两种亚型,参与细胞迁移、细胞增殖、细胞粘附、细胞骨架重组等多种细胞行为,而这些功能又参与许多心血管疾病的发生、发展,而ROCK参与细胞迁移的分子机制尚不十分清楚。有文献报道,MAPK家族成员参与细胞的增殖和迁移,如p38 MAPK,ERK(胞外信号调节激酶)。此外在细胞迁移过程中,基质金属蛋白酶(MMPs)可以广泛降解ECM,为VSMC的迁移扫清道路,促进VSMC的迁移。本实验研究目的在于通过PDGF介导血管平滑肌细胞迁移的模型,阐述ROCKⅠ亚型调控血管平滑肌细胞研究的分子机制,为阐明动脉粥样硬化发生机理提供理论依据。 方法:(1)利用瞬时转染和稳定转染方法过表达ROCKⅠ,通过RNA和蛋白水平检测ROCKⅠ的表达情况;(2)利用Boyden chamber和划痕方法,检测ROCKⅠ过表达后,细胞的迁移情况;(3)利用Western blot方法,在10ng/ml PDGF刺激下,检测p-ERK和p-p38在不同时间的表达情况;(4)利用Western blot方法,在不同浓度U0126(ERK抑制剂)和SB203580(p38抑制剂)处理下,检测p-ERK和p-p38表达情况;(5)利用Boyden chamber法,在不同浓度U0126和SB203580处理下,检测对细胞迁移的影响;(6)利用Western blot和明胶酶谱法,检测U0126和SB203580对MMP2蛋白表达和活性的影响;(7)利用免疫荧光方法,在不同浓度U0126和SB203580处理下,检测抑制剂对细胞伪足形成的影响。 结果:(1)瞬时转染ROCKⅠ过表达后,细胞迁移明显增加;(2) PDGF (10ng/ml)刺激下,p-ERK和p-p38表达水平分别出现峰值;(3)不同浓度U0126和SB203580处理下,p-ERK和p-p38表达随浓度依赖性下降;(4)在不同浓度U0126和SB203580处理下,细胞迁移能力随浓度依赖性下降;(5)U0126和SB203580均降低MMP2的蛋白表达和活性; (6)U0126和SB203580减少细胞伪足的形成。 结论:(1)进一步证实ROCKⅠ与血管平滑机细胞的迁移密切相关; (2) PDGF介导的细胞迁移,可能是通过Rho/ROCK/MAPK通路实现的,并通过降解细胞外基质,为细胞迁移提供条件。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R363
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本文编号：2535599
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