17-β雌二醇通过下调PTEN抑制过氧化氢诱导鼠脊髓星形胶质细胞凋亡的相关研究

发布时间：2019-09-15 22:32

【摘要】：目的：采用新生1~3天的Sprague-Dawley（SD）大鼠，提取其脊髓星形胶质细胞后，并进行培养传代及鉴定。方法：取新生1~3天的Sprague-Dawley大鼠2只，提取其脊髓制成悬液后，以107~109个/L转移至75cm2培养瓶中，放入（37℃、5%CO_2）培养箱中培养，通过差速贴壁、不同速度的摇床技术及逐渐传代纯化星形胶质细胞，观察细胞形态的变化，并通过免疫荧光染色鉴定星形胶质细胞。结果：通过差速贴壁和不同速度的摇床技术结合可获得较高纯度的星形胶质细胞，并随着传代次数的增加，细胞进一步得到纯化，形态逐渐发生变化；培养的细胞GFAP染色呈阳性，显示星形胶质细胞呈多边形，胞膜光滑，边界清楚，胞突长且相互连接。结论：从乳大鼠的脊髓中可提取原代的星形胶质细胞，并应用差速贴壁和不同速度的摇床技术结合可获得较高纯度星形胶质细胞。目的：确定过氧化氢作用于星形胶质细胞的适当浓度，制作理想的大鼠脊髓星形胶质细胞损伤模型；观察17-β雌二醇对星形胶质细胞的形态及生存率的影响。方法：在成功培养星形胶质细胞的基础上，采用不同质量浓度（1mmol/L、800μmol/L、600μmol/L、400μmol/L、200μmol/L、100μmol/L）的过氧化氢处理星形胶质细胞，制作其损伤模型，并运用MTT比色法检测不同质量浓度的过氧化氢对星形胶质细胞的毒性作用，测定其在490nm处吸光度值（该值可反映星形胶质细胞代谢活性的强弱，间接反映星形胶质细胞的活性）。按下列公式计算抑制率：抑制率(IR％)=(1一处理组平均吸光度值／对照组平均吸光度值)×100％，并确定星形胶质细胞半数致死时过氧化氢的浓度，，即抑制率为50%时过氧化氢的浓度。在确定过氧化氢的作用浓度后，按实验分组处理细胞，观察17-β雌二醇对星形胶质细胞形态及其吸光度值的影响。结果：结果显示，随着过氧化氢浓度的增加，对星形胶质细胞的抑制率越大，星形胶质细胞凋亡的越多；过氧化氢的浓度为400μmol/L时，抑制率约为50%，因此采用400μmol/L的过氧化氢制作星形胶质细胞损伤模型；过氧化氢处理后细胞的吸光度值降低，然而，17-β雌二醇预处理组，其吸光度值增加（F=69.69P=0.0050.01）。结论：过氧化氢作用后，星形胶质细胞的形态发生变化，并发生了凋亡；17-β雌二醇能部分抑制过氧化氢对鼠脊髓星形胶质细胞的损害作用，改善星形胶质细胞的活力，即发挥对星形胶质细胞的保护作用。目的：探讨17-β雌二醇抑制过氧化氢诱导鼠脊髓星形胶质细胞凋亡的可能的具体作用机制，以期为临床急性脊髓损伤的治疗提供基础实验资料。方法：在成功建立星形胶质细胞损伤模型后，用20nmol/L17-β雌二醇进行干预。通过光镜观察17-β雌二醇对星形胶质细胞形态的影响，MTT方法检测活力后应用蛋白免疫印迹发检测其对鼠脊髓星形胶质细胞第10号染色体缺失的磷酸酶与张力蛋白同源物基因(Phosphatase and tensin homologue deleted fromchromosome10PTEN)、磷酸化蛋白激酶B（Phosphorylation of protein kinaseB p-PKB或p-Akt）、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）和B细胞淋巴瘤/白血病-2基因（B cell lymphoma/lewkmia-2Bcl-2）蛋白的表达的影响。结果：与对照组比较，过氧化氢处理后细胞PTEN、caspase3蛋白表达增加，Bcl-2、p-Akt蛋白表达减少，而17-β雌二醇预处理组与过氧化氢组比较，PTEN蛋白表达降低(F=290.003P=0.0010.01)、Bcl-2蛋白表达上调（F=115.916P=0.0010.01）；caspase-3蛋白表达降低(F=46.158P=0.0230.05)、p-Akt蛋白表达上调（F=49.173P=0.0330.05）。结论：17-β雌二醇可能通过下调PTEN蛋白，促进p-Akt蛋白的表达，影响Bcl-2、caspase-3蛋白的表达，最终抑制过氧化氢诱导星形胶质细胞凋亡，发挥对星形胶质细胞的保护作用，从而减轻脊髓损伤，促进脊髓神经功能的恢复。因此，脊髓损伤后早期应用雌激素配合其它药物阻止胶质细胞的凋亡可能有助于减轻脊髓损伤的损害程度，促进脊髓神经功能的恢复。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

【参考文献】