柯萨奇病毒A16的分离及其灭活疫苗的免疫原性研究

发布时间：2019-09-17 04:41

【摘要】：手足口病(Hand foot and mouth disease, HFMD)是一种常见的传播途径复杂、传染性较强、在短时间内可造成大规模流行的病毒感染性疾病,柯萨奇病毒A16型(Coxsackievirus A16, CA16)是其主要病原体之一,感染率常常超过感染总人数的60%,至今还没有十分安全有效的疫苗和特效药来预防和治疗CA16感染。因此,研制出安全、有效的CA16疫苗对于手足口病的预防和控制至关重要。本课题从粪便中分离CA16,用现代化微载体技术制备CA16灭活疫苗,免疫小鼠,并对其免疫原性进行评价,为疫苗的研制提供了研究基础。本研究工作包括4个部分：(1)CA16的分离、鉴定；(2)CA16生物学特性研究；(3)微载体培养CA16并纯化；(4)CA16全病毒灭活疫苗的免疫原性检测。 (1)CA16的分离、鉴定本研究选用Vero细胞从临床标本中分离肠道病毒,并用RT-PCR初步鉴定是否含有CA16,将从编号为DC1的标本中分离到的野毒株经过三轮蚀斑筛选后形成大小均一的空斑,挑取单克隆,并放大培养至第7代(DC1P7),经RT-PCR、测序、电镜观察、免疫荧光等证明DC1P7为CA16,同时对本次分离的CA16VP1区进行系统进化分析,判定该CA16毒株属于B2a亚型。 (2)CA16生物学特性研究为了后期规模化培养CA16并纯化,首先对与此相关的CA16生物学特性进行研究,结果发现：①培养基中小牛血清浓度和pH对病毒的增殖有重要影响：选用GlBCO公司的DMEM培养基,无血清培养96h后CA16几乎不病变或病变异常,血清浓度0.5%-2.5%时似乎随着血清浓度的增加病变率增加；②培养基中NaHCO3浓度为0.165%左右时CA16增殖最快；③PEG沉淀和氯仿抽提对病毒滴度损失较大,且纯化效果不佳,不能用于后期抗原的纯化。④CA16在增殖过程中一部分释放到培养液上清,但主要存在于细胞内；⑤CA16对高温敏感,-20℃以下可长期保存。 (3)微载体规模化培养CA16并纯化本实验中使用浓度为3g/L微载体培养Vero细胞和制备大量CA16, Vero细胞在微载体上培养5～7天长成单层,接种适量CA16病毒液至微载体上单层Vero细胞,72h后CPE达80%以上,收毒,感染滴度约3.56×1010TCID50/ml,经蔗糖密度梯度离心纯化后出现清晰灰白条带,在电镜下检测发现45%-60%蔗糖区间带和45%蔗糖带中有较多CA16病毒颗粒,且较纯。 (4)CA16全病毒灭活疫苗的免疫原性检测将经蔗糖密度梯度离心初步纯化的CA16抗原吸出、透析除去蔗糖并浓缩,用β-丙内酯灭活后与A1(OH)3佐剂一起免疫动物,以免疫剂量8.6×104TCID50/只,分0,2,4周免疫三次,结果显示：本实验制备的CA16全病毒灭活疫苗具有较好的免疫原性,血清IgG抗体和中和抗体效价峰值分别达1:512、1:128,GMT分别为1：161.27、1：73.52。本论文成功地应用Vero细胞分离出CA16,并对其相关生物学特性进行研究,采用微载体培养技术制备的CA16全病毒灭活疫苗具有较好的免疫原性,为疫苗的研制提供了研究基础。
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392.1

【参考文献】