脂肪来源的间充质干细胞体外转分化内皮细胞及褪黑素调控研究

发布时间：2019-10-02 13:12

【摘要】：目的：人脂肪来源的间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells, hADSCs)是一种具有很强的体外增殖能力和分化潜能的干细胞,因存在生物学特性稳定、来源充足、易于体外培养等优势已引起各国学者的关注。本研究旨在：①建立hADSCs的原代培养体系,并在无血清培养基中将其转化为内皮细胞；②观察hADSCs与聚ε-己内酯共聚物可降解材料的相容性,增长速率以及转分化为内皮细胞的程度,为hADSCs成血管的临床应用提供体外的研究依据；③观察褪黑素对hADSCs转分化内皮细胞和血管形成过程中,内皮细胞表型vWF、VE-cadherin表达,细胞内游离钙离子浓度以及ERK、p-ERK表达的变化,探索褪黑素对hADSCs转分化为内皮细胞的促进、血管形成及保护机制。 方法：从健康人体抽脂术获得的脂肪,利用本实验室建立的培养方法,进行hADSCs的原代培养,并用流式细胞术检测免疫表型和成骨和脂肪细胞分化实验检测其干细胞的分化能力;用含40ng/ml的VEGF和10ng/ml的bFGF的无血清分化培养基诱导hADSCs分化为内皮细胞。流式细胞仪检测vWF和VE-Cadherin两种内皮细胞特异性表达抗原,透射电镜检测WP小体、成血管实验和Dil-Ac-LDL摄取实验来检测是否分化为内皮细胞。将hADSCs种植在孔径分别为60-80μm和180-200μm的聚ε己内酯共聚物材料上,计算接种率。用扫描电镜及免疫荧光标记发观察细胞在材料上的分布及相容性,CCK-8法绘制增殖曲线。在材料进行hADSCs向内皮细胞分化实验,分化50天后用流式细胞术检测内皮细胞表型vWF和VE-Cadherin,及免疫荧光法检测Flk-1。选择不同浓度(10、1.0和0.1μmol/L)的MT作用于第三代hADSCs处理8d后,用流式细胞术检测vWF和VE-Cadherin变化。用激光共聚焦显微镜检测Fluo-3标记的细胞胞质内游离钙离子浓度([Ca2+]i)变化。将不同浓度MT处理24 h的hADSC种植至Matrigel胶上,观察细胞成血管能力。利用Western blot技术分析MT处理8d后hADSCs的ERK和p-ERK表达水平。 结果：①hADSCs经流式细胞术分析,CD45 (-) CD14 (-) CD44 (+) CD29 (+) CD105(+)表明该细胞为人脂肪来源的间充质干细胞,并且可分化成骨成脂细胞。随着分化时间的延长,vWF和VE-Cadherin的表达不断增加,并且可在电镜下观察到WP小体的出现以及在光镜下观察到分化30天的hADSCs具有成血管的能力和摄取Dil-Ac-LDL的能力。②种植到材料上后,扫描电镜下观察细胞呈长梭形依附于多孔材料表面。60-80μm孔径的材料细胞接种率为(98.33±0.33)%,明显大于180-200μm孔径材料上的细胞接种率(90.33±1.45)%；增殖曲线亦是如此。选择60-80μm孔径的材料进行内皮细胞分化实验发现,分化50天后,流式细胞术检测vWF和VE-cadherin的阳性率分别为(80.9±0.90)%和(84.3±1.10)%，免疫荧光化学检测Flk-1显示大多数细胞表面均表达Flk-1。③1Oμmol/LMT处理的hADSCs的vWF(13.15±4.55)%和VE-Cadherin (17.96+8.74)%较空白对照组的vWF和VE-Cadehrin无显著性差异(P0.05)；而1μmol/L MT处理的hADSCs的vWF(19.99±1.74)%和VE-Cadherin(21.13±9.74)%,以及0.1μmol/LMT处理的hADSCs的vWF(43.66±0.89)%和VE-Cadherin(49.42±4.92)%,均明显高于空白对照组(P0.05)。40μmol/L预处理24小时后再给予MT的hADSCs的vWF和VE-cadherin阳性率均明显低于MT直接加药组。10、1.0和0.1μmol/L MT处理8天后的细胞胞质内[Ca2+]i较非MT分化8天组分别升高-46.02%、12.27%和99.09%。在倒置相差显微镜下发现,1.0和0.1μmol/L MT处理24h后,hADSC形成血管管腔结构；空白对照组和10μmol/LMT组hADSCs无血管管形结构形成,40μmol/L预处理24小时后再给予MT的hADSCs也无法形成血管管形结构。与空白对照组相比,0.1μmol/LMT处理组hADSC p-ERK水平明显增高(P0.05),1Oμmol/L组p-ERK降低显著(P0.05),而三个不同浓度药物组ERK水平和空白组相比无显著性差异(P0.05) 结论：①本实验成功从人体脂肪中分离得到间充质干细胞,并且在无血清条件下可将其分化为内皮细胞。②将hADSCs种植在孔径分别为60-80μm和180-200μm的聚ε-己内酯共聚物材料上,孔径大小为60-80μm聚ε-己内酯共聚物材料较适合于hADSCs的生长和增殖,并可在材料上有效分化为内皮细胞。③1和0.1μmol/LMT可以明显促进hADSCs向EC分化,其机制为通过促进[Ca2+]i的增加,激活细胞分化过程中的ERK/MAPK信号通路。
【图文】：

2.hA0scs的生物学性状及接种率原代细胞在72h后贴壁，细胞如刷状或旋涡状生长(图1)，原代培养30d左右时80%一90%乡I!胞汇合，免疫表型表达为Co45(一)、Coi4(一)、eo44(+)、Co29(+)和CO105(+)。细胞容易成团排列在材料[产仁长(图2)，夕手且分布在材料不同层次的厚度土，因而使荧光产生不同的强度和清晰度。小孔径材料上的细胞接种率98.3%士0.3%，，显著高于大孔径的90.3%士1.5%(P<0.05)。图1月旨肪来源的间充质「细胞原代 F191PrimaryeultureofhADSCs(只100)图ZDAP一标记不」lJ孔径才」料巨hADSCs的细j泡核 F192hADSCsiabeledwithDAplonthedifferentaPertUresofpolv一￡一eaprolaetonematerials(又100)

3.扫描电镜形态学观察细胞接种于材料上72h后，细胞吸附于材料表面，细胞形态多呈长梭形，少数呈短梭形，细胞表面有微绒毛等突起，细胞跨越微孔表面或向孔内生长(图3)。小孔径材料上的细胞较大孔径的细胞数目明显增多。图3扫描电镜观察不同孔径上的材料 Fig3hADSCsonthedifferentaPerturesobservedthroughscanningeIeetronmieroseoPe A.hADSCsonmaterialwithPorediameterof60~80pm(X200);B.hADSCsonmateriaIwithPorediameterof60一80 m(X500);C.hADSCsonmaterialwithPorediameterof180~200pm(义 200);D.hADSCsonmaterialwithPore diameterof180、200口 m(X500)4.增殖曲线的测定利用CCK一8法在24孔板内连续7天检测细胞在材料上的增殖情况。细胞在第3天进入对数生长期。在起始细胞数目相同的条件下，自第2天起，小孔径材料上的细胞增殖幅度大于大孔径材料上的细胞(表1)。综合细胞接种率结果说明:聚。一己内酷生物材料材料更利于细胞的生长及增殖，但孔径为60一80pm材料细胞负载量大于孔径为180一200州m材料。因此，我们选用60一80尸m孔径材料进行内皮细胞分化实验。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R329

【参考文献】

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本文编号：2544953