Netrin-1基因对胎盘血管生成作用的体内、外研究

发布时间：2019-10-10 13:21

【摘要】：第一部分RNA干扰体外沉默HUVECs的Netrin-1基因表达 目的 通过体外RNA干扰技术稳定沉默Netrin-1基因在HUVECs mRNA和蛋白水平的表达,为后续的细胞实验提供基础。 方法 1.分离、培养原代HUVECs,利用细胞形态学和免疫荧光实验鉴定细胞表面Ⅷ因子和CD31的表达以验证其内皮细胞特性； 2.利用RNA干扰技术将表达Netrin-1 shRNA的真核表达载体瞬时转染入HUVECs,并利用G418稳定筛选； 3.利用实时荧光定量PCR检测HUVECs在RNA干扰前后Netrin-1基因的mRNA水平表达； 4.利用免疫印迹法检测HUVECs在RNA干扰前后Netrin-1基因的蛋白水平表达。 结果 1.分离所得的原代HUVECs,细胞形态学具有内皮细胞特性,免疫荧光鉴定Ⅷ因子和CD31的表达强阳性； 2.RNA干扰技术体外稳定转染后可得到GFP稳定高表达的HUVECs; 3. HUVECs稳定转染shNetrin-1后,实时荧光定量PCR检测发现其Netrin-1基因的mRNA水平表达下降了(86.54±3.10)%； 4. HUVECs稳定转染shNetrin-1后,免疫印迹法检测发现其Netrin-1基因的蛋白水平表达下降了(77.62±6.92)%。 结论 利用体外RNA干扰技术可稳定高效沉默Netrin-1基因在HUVECs mRNA和蛋白水平的表达,为进一步的细胞生物功能学研究奠定了实验基础。 第二部分Netrin-1基因对HUVECs与血管形成相关能力的作用 目的 研究上调和下调Netrin-1的表达对HUVECs细胞活力、增殖、迁移和管腔形成能力的影响,了解Netrin-1基因在HUVECs形成血管过程中的作用。 方法 1.将HUVECs分为对照组(细胞转染空白质粒shVetor,在普通培养基中培养),Netrin-1组(细胞转染空白质粒shVetor,在含100ng/ml Netrin-1的条件培养基中培养),shNetrin-1组(细胞转染目的质粒shNetrin-1,在普通培养基中培养)3组； 2.利用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT)比色法分别检测3组HUVECs12、24、48小时的细胞活力； 3.利用克隆形成法检测3组HUVECs的增殖能力； 4.利用transwell模型迁移实验检测3组HUVECs的迁移能力； 5.利用小管形成实验检测3组HUVECs的管腔形成能力。 结果 1.给予Netrin-1刺激24小时后,HUVECs细胞活力明显提高；沉默Netrin-1的表达24小时后,HUVECs细胞活力明显下降； 2. Netrin-1干预的HUVECs克隆形成率由shVector组的(60±6.67)%提高至(92.22±5.09)%；沉默Netrin-1表达的HUVECs克隆形成率则降至(30±3.33)%(p0.05); 3.与shVector组(81.8±7.95)相比,Netrin-1组HUVECs的细胞迁移数目可达(124.2±15.9);shNetrin-1组HUVECs的细胞迁移数目降至(40.4±8.56)(p0.05)； 4.与shVector组(32.6±3.13)相比,Netrin-1可增加HUVECs管腔形成分支点 数目(57.4±6.88)；沉默Netrin-1则使其减少(19.6±4.45)(p0.05)。 结论 外源性给予Netrin-1可以促进HUVECs的细胞活力、增殖、迁移和管腔形成能力；沉默Netrin-1表达则可以抑制HUVECs以上与血管形成相关的各项生物学功能。Netrin-1是重要的促HUVECs细胞活力、增殖、迁移和管腔形成能力的基因。 第三部分RNA干扰体内沉默孕鼠胎盘的Netrin-1基因表达 目的 通过体内RNA干扰技术沉默Netrin-1基因在孕鼠胎盘mRNA和蛋白水平的表达,为后续动物水平的研究提供实验基础。 方法 1.利用体内RNA干扰技术将表达Netrin-1 shRNA的真核表达载体转染入孕鼠胎盘组织； 2.转染后的孕鼠组织行冰冻切片,荧光显微镜下观察GFP表达以了解质粒的转染效果； 3.利用实时荧光定量PCR检测RNA干扰前后的孕鼠胎盘组织Netrin-1基因的mRNA水平表达； 4.利用免疫印迹法和免疫组化实验定量和定位检测RNA干扰前后的孕鼠胎盘组织Netrin-1基因的蛋白水平表达。 结果 1.转染后胎盘组织的冰冻切片在荧光下观察可见GFP大面积高表达,体内转染效果理想； 2.孕鼠胎盘体内转染shNetrin-1后,实时荧光定量PCR检测发现其Netrin-1基因的mRNA水平表达下降(63.49±9.58)%； 3.孕鼠胎盘体内转染shNetrin-1后,免疫印迹法发现其Netrin-1基因的蛋白水平表达下降(57.93±11.76)%；免疫组织化学实验显示Netrin-1主要表达于胎盘血管内皮细胞。 结论 利用体内RNA干扰技术可有效沉默Netrin-1基因在孕鼠胎盘mRNA和蛋白水平的表达,为后续动物水平的在体研究奠定了实验基础。 第四部分Netrin-1基因对胎盘血管生成和胎儿发育的作用 目的 研究上调和下调Netrin-1的表达对孕鼠胎盘血管生成和胎鼠发育的影响,了解Netrin-1基因在胎盘血管形成过程中的作用。 方法 1.将56只孕鼠随机分成4组,孕14天时行相应的胎盘定位注射：对照组(20ul生理盐水),Netrin-1组(20ul含400ng重组Netrin-1因子的生理盐水),shVector组(20ul含10ug shVector的转染复合物),shNetrin-1组(20ul含10ug shNetrin-1的转染复合物); 2.测量孕17天大鼠干预注射后胎盘及胎鼠的重量； 3.利用CD34因子免疫组化实验检测孕17天大鼠干预注射后的胎盘血管密度。 结果 1.与对照组(1.57±0.1)g相比,Netrin-1组孕鼠的胎盘重量(1.83±0.12)g明显增加；与shVector组(1.53±0.11)g相比,shNetrin-1组孕鼠的胎盘重量(1.35±0.09)g明显下降(p0.05)； 2.CD34的免疫组化实验结果显示,Netrin-1组孕鼠胎盘的微血管数量(98.4±9.07)较对照组(80.2±5.89)显著增多；shNetrin-1组孕鼠胎盘的微血管密度(54.0±5.34)较shVector组(75.6±7.3)显著减少(p0.05)； 3.与对照组(2.46±0.18)g相比,Netrin-1组的胎鼠重量(2.67±0.10)g增加；与shVector组(2.40±0.14)g相比,shNetrin-1组的胎鼠重量(2.10±0.20)g下降(p0.05)。 结论 外源性给予Netrin-1可以促进孕鼠胎盘的血管形成能力和胎鼠的生长发育；沉默Netrin-1表达则可以使孕鼠胎盘的血管形成能力和胎鼠的生长发育受到抑制。Netrin-1基因是促胎盘血管生长发育的重要基因。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R321

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本文编号：2547195